Gereç ve Yöntem: Sağlıklı 15 kadının herbirinden 6 mL periferik kan örneği alınarak RosetteSep yöntemiyle 3x106 adet CD3+T-hücre izole edildi. CD3+T-hücreleri fazkontrast mikroskopta sayıldı ve izolasyon saflıkları immunfloresan ve akım sitometrik yöntemlerle belirlendi. 12 kuyucuklu kültür kabının 3’er kuyucuğuna 2x105 adet paylaştırılan hücrelere 10 μg/mL PHA, 13μL/mL IL-2 ve 10 μg/mL PHA+13μL/mL IL-2 uygulanarak 24 saat inkübatörde inkübe edildi. Uyarıcıyla uyarılmamış CD3+T-hücreleriyle (kontrol grubu) karşılaştırılan uyarılmış CD3+T–hücre gruplarının; çoğalımları spektrofotometrik yöntemle WST-1 testi ve akım sitometride CFSE testi ile aktivasyon moleküllerinin ekspresyonları CD25,CD38,CD69,CD71 ve HLA-DR antikorları ile akım sitometride ölçüldü.

Bulgular: WST-1 ve CFSE test değerleri gruplar arasında istatistiksel olarak karşılaştırıldığında; PHA-CD3+T-hücrelerinin (p <0.001) ve PHA+IL-2-CD3+T-hücrelerinin (p <0.001) IL-2-CD3+T-hücrelerinden anlamlı olarak daha fazla çoğaldıkları yani uyarıldıkları tespit edildi. Akım sitometride ölçülen aktivasyon moleküllerinin düzeyleri gruplar arasında istatistiksel olarak karşılaştırıldığında; IL-2-CD3+T-hücrelerine kıyasla, PHA-CD3+T-hücrelerinde ve PHA+IL-2-CD3+T-hücrelerinde CD25 (p <0.001), CD38 (p <0.001), CD71 (p <0.001) ve HLA-DR (p <0.001) % ekspresyon düzeylerinde anlamlı artış tespit edildi.

Sonuç: PHA ve PHA+IL-2 ile uyarılan CD3+T-hücrelerinde hücre proliferasyonunun ve aktivasyon molekülleri düzeylerdinin benzer olduğu ve IL-2 ile uyarılan hücrelere kıyasla fazla olduğu tespit edildiğinden, invitro çalışmalarda CD3+T-hücre uyarıcısı olarak PHA kullanılmasının başka bir uyarıcıya gerek duyulmaksızın tek başına etkin olduğu ve CD3+T-hücrelerde IL-2’ye kıyasla daha fazla çoğalımı ve uyarılmayı sağladığı sonucuna varıldı.

Ayrıca CD3+T-hücrelerinin PHA tarafından uyarılması, hücrenin hücre döngüsünün hareketsiz G0 fazından G1 fazına klasik bir geçiş modelini ve daha sonra döngünün S- G2- ve M-fazları boyunca ilerlemesini göstermektedir ¹⁹. Araştırmacılarca, T-hücrelerinin aktiflendiğinde hareketlerinin arttığı, çoğaldığı ve yüzeylerinde birçok aktivasyon molekülünü ekspresse ettiği ve bunun sonucunda da morfolojilerinin değişerek yapısında bazı uzantılara sahip oldukları açıklanmıştır ^20-29.

PHA ve IL-2, T-hücrelerinin invitro ortamda çoğalabilmeleri ve hücre yüzey aktivasyon moleküllerini ekspresse etmeleri için kullanılan uyarıcılardandır. Uyarıcılarla uyarılan T-hücreleri CD25, CD38, CD69, CD71 ve HLA-DR gibi antijenleri yüzeylerinde ekspresse ederler ki bunlar dinlenme halindeki T-hücrelerinde ya çok az ekspresse edilir ya da hiç edilmezler ^{20,22,24-26,30-33}. Bu yüzden bunlara ‘aktivasyon molekülleri’ adı verilir. Bu aktivasyon molekülleri monoklonal antikorlar (mAbs) kullanılarak immünfloresan yöntemle (IF) ve akım sitometrik analizlerle kolaylıkla tespit edilebilirler. Yakın zamanlarda yapılan çalışmalar, PHA ile uyarılmış T-hücrelerinin hücresel cevabında aktivasyon moleküllerinden CD25, CD69, CD71 ve HLA-DR’nin hızlı ekspresse olduğunu göstermiştir ^24,34-36.

Bu çalışmada, CD3+T-hücrelerinin uyarılmasında en etkin uyarıcının ya da uyarıcıların tespit edilmesi ayrıca uyarıcıların birlikte kullanılmasının uyarılmayı arttırıcı etkisi olup olmadığının belirlenmesi hedeflendi. Bu amaçla, sağlıklı insan periferik kanından izole edilmiş CD3+T-hücrelerinin PHA ve IL-2 ile ayrı ayrı ve her iki uyarıcı ile birlikte uyarıldıklarında hücre çoğalımları ve hücre yüzey aktivasyon moleküllerinin ekspresyonlarındaki değişimin ölçümü gerçekleştirildi.

Periferik Kandan CD3+T-hücrelerinin İzolasyonu, Tespiti ve Sayımı
Sağlıklı 15 kadın gönüllünün her birinden 6’şar mL periferik kan örneği EDTA’lı tüplere alındıktan sonra bu kanlardan periferik kan havuzu oluşturuldu. CD3+T-hücreleri, T-hücre negatif immün seleksiyon kokteyli olan RosetteSep kiti (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC, Canada) kullanılarak izole edildi. CD3+T-hücrelerinin varlığı invört mikroskopta (Leica Wetzlar, Germany) tespit edildi ve fotoğrafları çekildi. Daha sonra Thoma lamı kullanılarak faz-kontrast mikroskopta sayıldı (Leica Wetzlar, Germany) ve toplamda 3x10⁶ CD3+T-hücresi olduğu tespit edildi.

CD3+T-hücrelerinin anti-CD3 Antikoruyla İmmünfloresan (IF) Yöntemle Boyanması
CD3+T-hücreler soğuk metanolde (Merck Kenilworth, New Jersey, United States) fikse edildi. Hücrelerin %0.025 Triton X-100 (Merck, Merck Kenilworth, New Jersey, United States) ile permeabilizasyonu sonrası hücreler %1.5 normal keçi yada eşek bloke edici serumla (Santa Cruz,California,USA) PBS’de non-spesifik bağlı immunoglobulin G’nin supresyonu için inkübe edildi. Yıkama sonrası hücreler, primer anti-CD3 antikoruyla gece boyu inkübe edildi. Daha sonra hücreler primer antikora uygun FITC-işaretli sekonder antikorla (Santa Cruz, California, United States) inkübe edildi. Yıkama sonrasında hücreler %10FBS, 100 U/mL penicillin, 0.1mg/mL streptomycin, and 200 mM glutamax (Invitrogen/GIBCO, Waltham, Massachusetts, USA) içeren RPMI-1640 besiyeri (Invitrogen/GIBCO, Waltham, Massachusetts, USA) içinde DAPI boyasında (Santa Cruz, California, United States) inkübe edildi. Ardından immünfloresan mikroskobuyla (Leica Wetzlar, Germany) CD3+T-hücreleri tespit edilerek fotoğrafları çekildi.

CD3+T-hücrelerinin İzolasyon Saflık Analizinin Akım Sitometri Cihazında Ölçümü
CD3+T-hücrelerinin izolasyonunun saflık analizi akım sitometri cihazında (Becton Dickinson, FACS Calibur, San Jose, CA, USA) %90,63 olarak ölçüldü. Bu yöntemde, izole edilen CD3+T-hücre süspansiyonu 10 μL PerCP-konjuge anti-CD3 hücre yüzey monoklonal antikoru ile (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) 15 dakika oda ısısında karanlıkta inkübe edilmesinin ardından akım sitometri cihazında ölçüldü.

CD3+T-hücrelerinin PHA, IL-2 ve PHA+IL-2 ile Uyarılması
Oniki kuyucuklu kültür plağının 3’er kuyusuna 2x105 hücre/kuyucuk olacak şekilde paylaştırılan 3 farklı gruptaki CD3+T-hücreleri, %10 FBS, 100 U/mL penicillin, 0.1 mg/mL streptomycin ve 200 mM glutamax (Invitrogen/GIBCO) içeren RPMI-1640 (Invitrogen/GIBCO) besiyerindeki uyarıcılarla 24 saat inkübe edildi. Herhangi bir uyarıcıyla uyarılmayan 2x105 hücre/kuyucuk olan (kontrol grubu) CD3+T-hücreleri de 3 ayrı kuyuya aynı besiyerinde pipetlendi. Birinci gruptaki CD3+T-hücreleri herhangi bir uyarıcıyla uyarılmadan (kontrol grubu), 2. gruptaki CD3+T-hücreleri 10 μg/mL PHA ile (PHA; Invitrogen/GIBCO, Waltham, Massachusetts, USA) uyarılarak, 3.gruptaki CD3+T- hücreleri 13μL/mL IL-2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri United States) ile uyarılarak ve 4.gruptaki CD3+T-hücreleri 10 μg/mL PHA ve 13μL/mL IL-2 ile uyarılarak %5CO2 içeren 37°C inkübatörde (Sanyo MCO-20AIC, Moriguchi, Osaka, Japan) 24 saat inkübe edildi.

Uyarılmış CD3+T-hücrelerin Faz-Kontrast Mikroskopta Görüntülenmesi
CD3+T-hücrelerin uyarıldığında oluşan morfolojik değişikliklerinin görüntüsü faz-kontrast mikroskopta (Leica Wetzlar, Germany) gözlenerek fotoğrafları çekildi.

Uyarılmış ve Uyarılmamış CD3+T-hücre Çoğalımının WST-1 Testiyle Ölçümü
PHA, IL-2, PHA+IL-2 ile uyarılmış ve uyarılmamış CD3+T-hücre gruplarının çoğalımlarının tayini spektrofotometrik yöntemle WST-1 testi (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) ile gerçekleştirildi. Bunun için, CD3+T-hücreleri her gruptan 3’er örnek ve 1x105 hücre/kuyucuk olacak şekilde 96 kuyucuklu kültür plağının 3’er kuyucuğuna pipetlendi. Tüm kuyucuklara 10μL WST-1 (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) ayıracı pipetlendi. Kültür plağı %5CO2 içeren 37°C inkübatörde 4 saat inkübe edildi. 4. saatin sonunda tüm kuyucuklardaki hücrelerin absorbans değerleri spektrofotometrik yöntemle 480 nm’de mikroplate okuyucuda (Elisa Versamax, Sunnyvale, CA, USA) okundu.

Uyarılmış ve Uyarılmamış CD3+T-hücre Çoğalımının CFSE Testiyle Ölçümü
PHA, IL-2 ve PHA+IL-2 ile uyarılmış ve uyarılmamış CD3+T-hücrelerinin CFSE (carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) % ekspresyon düzeyleri ve MCS ölçümleri akım sitometri cihazında ölçüldü. Bunun için her gruptaki CD3+T-hücreleri; DMSO (Dimetil sulfoksid) içinde hazırlanan CFSE çalışma ayracı (1-10 μM) ile işaretlenerek 15 dakika 37°C su banyosunda inkübe edildi ve düzeyleri akım sitometri cihazında ölçüldü.

Uyarılmış ve Uyarılmamış CD3+T-hücre Yüzey Aktivasyon Moleküllerinin Ölçümü
PHA, IL-2 ve PHA+IL-2 ile birlikte uyarılmış ve uyarılmamış CD3+T-hücrelerinin hücre yüzey aktivasyon moleküllerinin % ekspresyon düzeyleri ve MCS ölçümleri akım sitometri cihazında ölçüldü. Bunun için her gruptaki CD3+T-hücreleri; 10’ar μL PE-konjuge anti-CD25, PE-konjuge anti-CD38, APC-konjuge anti-CD69, PE-konjuge anti-CD71 ve PE-konjuge anti-HLA-DR hücre yüzey monoklonal antikorlarıyla (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) işaretlenerek 15 dakika oda ısısında karanlıkta inkübe edildi ve düzeyleri akım sitometri cihazında ölçüldü.

İstatistiksel Analiz
Bu çalışmada sürekli değişkenler için Shapiro-Wilks testi uygulandı. Değişkenler normal dağılım göstermediği için gruplar arası karşılaştırma Kruskal Wallis test ve Dunn Çoklu Karşılaştırma testi ile analiz edildi ve medyan (%25-%75) yüzdelik değerler olarak gösterildi. İstatistiksel analizler için IBM SPSS Statistics 22.0 (SPSS Inc., Chicago, Illinois) programı kullanıldı. İstatistiksel anlamlılık düzeyi p <0.05 olarak alındı.

WST-1 testi sonuçlarına göre; uyarılmamış CD3+T-hücreleri (1. grup, kontrol) ile karşılaştırıldığında; PHA-CD3+T-hücrelerinin (2. grup) (p <0.001) ve IL-2+PHA-CD3+T-hücrelerinin (4. grup) (p <0.001) istatiksel açıdan önemli çoğalım gösterdikleri yani uyarıldıkları tespit edildi. IL-2-CD3+T-hücrelerinde (3. grup) de istatistiksel açıdan önemli olmasa da kontrole kıyasla çoğalım farkı tespit edildi. Bunun yanısıra, IL-2-CD3+T-hücrelerine kıyasla, PHA-CD3+T-hücrelerinin (p <0.001) ve PHA+IL-2-CD3+T-hücrelerinin (p :0.006) istatiksel açıdan anlamlı olarak çoğalım gösterdikleri yani uyarıldıkları tespit edildi (Tablo 1).

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 1: RosetteSep kiti kullanılarak insan periferik kanından izole edilmiş CD3+T-hücrelerinin invört mikroskoptaki görüntüsü. Kitdeki antikor içeriğinin eritrositlerle ve diğer istenmeyen hücrelerle kompleks oluşturarak (rozet yapılar) (turuncu oklar) negatif seleksiyon ile çöktürülüp ortamdan uzaklaştırması sonucu saf CD3+T-hücreleri (yeşil oklar) tipik morfolojik özellikleriyle ayırt edilebilmektedir (Büyütme x100).

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 2: CD3+T-hücrelerinin IF yöntemle CD3 antikoruyla boyanması sonucu elde edilen IF mikroskoptaki görüntüsünde, hücrelerin yeşil renkte CD3 ve mavi renkte çekirdek boyası (DAPI) ışıması yaptığı ve T-hücrelerinin CD3 izolasyonunun gerçekleştiği gözlenmiştir.

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 3: CD3+T-hücrelerinin CD3 antikoruyla işaretlenmesi sonucu %90.63 düzeyinde saflıkla izole edildiklerini gösteren akım sitometri sonucu.

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 4: Yirmidört saat boyunca inkübatörde PHA ve IL-2 ile uyarılan CD3+T-hücrelerinin morfolojilerinin değiştiği ve yapılarında bazı uzantılar oluştuğu, hücrelerin yer yer kümeleştikleri faz-kontrast mikroskopta gözlemlendi.

Büyütmek İçin Tıklayın

Tablo 1: Değişkenlerin gruplararası karşılaştırılması sonuçları.

CFSE testi sonuçlarına göre; WST-1 testine benzer şekilde uyarılmamış CD3+T-hücreleri ile karşılaştırıldığında; PHA-CD3+T-hücrelerinin (p <0.001) ve IL-2+PHA-CD3+T-hücrelerinin (p <0.001) istatiksel açıdan önemli çoğalım gösterdikleri yani uyarıldıkları tespit edildi. Bunun yanı sıra, IL-2-CD3+T-hücrelerine kıyasla PHA-CD3+T-hücrelerinin (p :0.01) ve PHA+IL-2-CD3+T-hücrelerinin (p :0.001) anlamlı olarak çoğalım gösterdikleri yani uyarıldıkları tespit edildi (Tablo 1, Şekil 5).

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 5: Uyarılmamış CD3+T-hücre grubu (kontrol) ve tüm uyarılmış CD3+T-hücre gruplarının CFSE akım sitometri verileri.

Uyarılmış gruplardaki CD3+T-hücreleri aktivasyon moleküllerinin % ekspresyon düzeyleri uyarılmamış CD3+T-hücreleriyle karşılaştırıldığında, PHA-CD3+T-hücrelerinde; CD25 (p <0.001), CD69 (p <0.001) ve CD71 (p <0.001) değerlerinin, PHA+IL-2-CD3+T-hücrelerinde; CD38 (p <0.001), CD69 (p <0.001) ve HLA-DR (p <0.001) düzeylerinin istatistiksel açıdan anlamlı artış gösterdiği tespit edildi. Ayrıca IL-2-CD3+T-hücreleri ile karşılaştırıldığında, PHA-CD3+T-hücrelerinde CD25 (p <0.001), CD38 (p <0.001) CD71 (p <0.001) ve HLA-DR (p <0.001) düzeylerinin, PHA+IL-2-CD3+T-hücrelerinde ise; CD25 (p <0.001), CD38 (p <0.001), CD69 (p <0.001), CD71 (p <0.001) ve HLA-DR (p <0.001) düzeylerinin anlamlı olarak arttığı tespit edildi (Tablo 2, Şekil 6, Şekil 7, Şekil 8, Şekil 9).

Büyütmek İçin Tıklayın

Tablo 2: Değişkenlerin gruplararası karşılaştırılması sonuçları.

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 6: Uyarılmamış CD3+T-hücre grubu (1. grup, kontrol) aktivasyon moleküllerinin akım sitometri verisi.

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 7: PHA-CD3+T-hücre grubu (2. grup) aktivasyon moleküllerinin akım sitometri verisi.

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 8: IL-2-CD3+T-hücre grubu (3. grup) aktivasyon moleküllerinin MCS akım sitometri verisi.

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 9: PHA+IL-2-CD3+T-hücre grubu (4. grup) aktivasyon moleküllerinin akım sitometri verisi.

Yapılan birçok araştırmada, T-hücrelerinin uyarıldıklarında çoğaldıkları ve hücre yüzeylerinde birçok aktivasyon molekülünü ekspresse ettikleri açıklanmıştır. PHA gibi mitojen, IL-2 gibi sitokin ve LFA-1 gibi integrin yapısındaki uyarıcılar, T-hücrelerinin invitro ortamda çoğalabilmeleri ve bazı hücre yüzey aktivasyon molekülerini ekspresse etmeleri için kullanılmaktadır. Uyarıcılarla uyarılan T-hücreleri CD25, CD38, CD69, CD71 ve HLA-DR gibi aktivasyon moleküllerini ekspresse ederler ki bu moleküller dinlenme halindeki uyarılmamış T-hücrelerinde ya çok az sentez edilir ya da hiç edilmezler ^20-29,37.

Çalışmada, uyarılmamış CD3+T-hücrelerle karşılaştırıldığında; PHA ve PHA+IL-2 ile uyarılan CD3+T-hücrelerinin CD25, CD38, CD69, CD71 ve HLA-DR düzeylerinde ekspresyon artışı tespit edildi. CD3+T-hücreler IL-2 ile uyarıldığında ise, uyarılmamış hücrelere kıyasla sadece CD38 ve CD69 aktivasyon moleküllerinde ekspresyon artışı görüldü. Ayrıca CD25 ve CD71’in en yüksek ekspresyon değerleri PHA-CD3+T-hücrelerinde; CD38, CD69 ve HLA-DR’nin en yüksek ekspresyon değerleri PHA+IL-2-CD3+T-hücrelerinde tespit edildi.

Bunun yanı sıra, PHA ve PHA+IL-2 ile uyarılan CD3+T-hücrelerinden sentezlenen aktivasyon molekülleri ekspresyon düzeylerinde birbirine yakın düzeyler ölçülse de; IL-2 ile uyarılan CD3+T-hücrelerinden sentezlenen tüm aktivasyon moleküllerinde bu iki gruba oranla daha düşük düzeyler tespit edildi.

Uyarılan üç ayrı hücre grubunu aktivasyon molekülleri ekspresyonları açısından kendi içinde karşılaştırdığı-mızda, PHA-CD3+T-hücrelerinde CD25, CD38, CD71 ve HLA-DR düzeylerinin IL-2-CD3+T-hücrelerinden anlamlı düzeyde artış gösterdiği; PHA+IL-2-CD3+T-hücrelerinde ise CD25, CD38, CD69, CD71 ve HLA-DR düzeylerinin IL-2- CD3+T-hücrelerinden anlamlı düzeyde artış gösterdiği görüldü. PHA-CD3+T-hücreleri ve PHA+IL-2-CD3+T-hücrelerinden sentezlenen CD25 ve HLA-DR aktivasyon molekülleri yüzdeleri ise benzerdi.

Yapılan akım sitometri çalışmalarında PHA gibi mitojenik ve antijenik uyarıcılarla uyarılan T-hücrelerinden CD25, CD38, CD69, CD71 ve HLA-DR gibi hücre yüzey aktivasyon moleküllerinin sentezlendiği tespit edilmiştir. Ayrıca PHA ile uyarılan bu moleküllerden en fazla ekspresyonun CD25’de olduğu, ardından CD71, CD69 ve HLA-DR’nin geldiğini bildirilmiştir. ^24,30-33.

CD3+T-hücrelerinin uyarılmasına bağlı olarak çoğalımları değerlendirildiğinde; WST-1 ve CFSE testlerinde benzer sonuçlar elde edildi. Her iki testte de PHA-CD3+T-hücreler ve PHA+IL-2-CD3+T-hücreler birbirine yakın çoğalım düzeylerine sahipti. Ayrıca bu gruplar uyarılmamış CD3+T-hücreler ve IL-2-CD3+T-hücrelerle karşılaştırıldığında sayılarında anlamlı düzeyde artış olduğu tespit edildi. Benzer şekilde, PHA ve IL-2 ile uyarılan birçok T-hücre çalışmasında, uyarılmanın T-hücre çoğalımını arttırdığı bildirilmiştir ^25,28,38-41.

Böylece, uyarılmamış CD3+T-hücreler ve IL-2 ile uyarılan CD3+T-hücreler ile karşılaştırıldığında PHA ile ve PHA+IL-2 ile uyarılan CD3+T-hücrelerde, hem hücre çoğalımının hem de aktivasyon molekülleri ekspresyon düzeylerinin anlamlı olarak arttığı tespit edilmiş oldu. Hücrelerin PHA ve PHA+IL-2 ile uyarılmasında ise hücre çoğalımı ve aktivasyon molekülleri ekspresyon düzeyleri açısından istatistiksel açıdan anlamlı bir fark elde edilmediğinden invitro ortamda CD3+T-hücre uyarımı için tek bir uyarıcı olarak PHA’nin yeterli olacağı kanısına varılmış oldu. Sonuç olarak, bu çalışma CD3+T-hücrelerini PHA ve IL-2 ile ayrı ayrı uyarmanın yanısıra, PHA+IL-2 ile birlikte uyarmanın CD3+T-hücre çoğalım ve aktivasyon molekülü ekspresyonunu arttırıp arttırmadığını belirlemek amacıyla kurgulandı. En yüksek düzeyde hücre çoğalımı ve aktivasyon molekülleri ekspresyonu PHA ve PHA+IL-2 ile uyarılan CD3+T-hücrelerinde tespit edildi. Böylece, CD3+T-hücre uyarılmasında PHA’nin yalnız başına IL-2’ye ihtiyaç olmadan yeterli ve etkili bir uyarıcı olduğu sonucuna varılmış oldu.

Teşekkür: Çalışmalarım süresince değerli yardımlarıyla bana destek olan hocalarım Prof. Dr. Erdal Karaöz ve Doç. Dr. Ayla Eker Sarıboyacı’ya çok teşekkür ederim.

1) Germain RN. T cell development and the CD4-CD8 lineage decision. Nat Rev Immunol 2002; 2: 309-22.

2) Palmer E. Negative selection-clearing out the ad apples from the T cell repertoire. Nat Rev Immunol 2003; 3: 383-91.

3) Williams MA, Bevan MJ. Effector and memory CTL differentiation. Annu Rev Immunol 2007; 25: 171.

4) Camcıoğlu Y, Deniz G. Temel immünoloji, immün sistemin işlev ve bozuklukları: immün sisteme giriş. İstanbul Tıp Kitapevi 1. Baskı İstanbul 2007: 1-21.

5) Dardalhon V, Awasthi A, Kwon H, et al. IL-4 inhibits TGF-b-induced Foxp3+T cells and, together with TGF-β, generates IL-9+ IL-10+ Foxp3(-) effector T cells. Nat Immunol 2008; 9: 1347-55.

6) Wan YY, Flavell RD. How diverse- CD4 effector T cells and their functions. J Mol Cell Biol 2009; 1: 20-36.

7) Zhu J, Paul WE. Peripheral CD4+ T-cell differentiation regulated by networks of cytokines and transcription factors. Immunol Rev 2010; 238: 247-62.

8) Blanchard N1, Lankar D, Faure F, et al. TCR activation of human T cells induces the production of exosomes bearing the TCR/CD3/zeta complex. J Immunol 2002; 168: 3235-41.

9) Abbas AK, Lichtman AH, Pillai S. Cellular and Molecular Immunology. 7/E Elseiver Saunders. Philadelphia, USA 2009: 173-203.

10) Başkan EB. T hücre immünitesi. Türkderm 2013; 47: 18-23.

11) DüzgünN.İmmünSistemTanıtımı.İchastaliklariromatoloji.medicine.ankara.edu.tr/files/2014; 97-122.

12) Katzen D, Chu E, Terhost C, et al. Mechanisms of human T cell response to mitogens: IL 2 induces IL 2 receptor expression and proliferation but not IL 2 synthesis in PHA-stimulated T cells. J Immunol 1985; 135: 1840-45.

13) Rothwell, L, Hamblin A, Kaiser P. Production and characterisation of monoclonal antibodies specific for chicken interleukin-2. Vet Immunol Immunopathol 2001; 83: 149-60.

14) Lawson S, Rothwell L, Lambrecht B, Howes K, Venugopal K, KaiserP. Turkey and chicken interferonγ, which share high sequenceidentity, are biologically crossreactive. Develop Compar Immunol 2001; 25: 69-82.

15) Zhou Z-H, Karnaukhova E, Rajabi M, Kozlowski S. Oversulfated chondroitin sulfate binds to che-mokines and inhibits stromal cell- derived factor-1 mediated signaling in activated T cells. PLoS ONE, DOI: 10.1371/journal. 2014; 9: 9: e94402.

16) Mire-Sluis AR, Wickremasinghe RG, Hoffbrand AV, Timms AM, Francis GE. Human T lymphocytes stimulated by phytohaemagglutinin undergoa single round of cell division without a requirement for interleukin-2 or accessory cells. Immunology 1987; 60: 7-12.

17) Herre J1, Marshall AS, Caron E, et al. Dectin-1 uses novel mechanisms for yeast phagocytosis in macrophages. Blood 2004; 104: 4038-45.

18) Ma J1, Becker C, Lowell CA, Underhill DM. Dectin-1-triggered Recruitment of Light Chain 3 Protein to Phagosomes Facilitates Major Histocompatibility Complex Class II Presentation of Fungal-derived Antigens. J Biol Chem 2012; 287: 34149-56.

19) Darzynkiewicz Z, Traganos F, Sharpless T, Melamed MR. Lymphocyte stimulation: a rapid multiparameter analysis. 1976; Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 73: 2881-4.

20) Ko HS, Fu SH, Winchester RJ, Yu DTY, Kunkel HG: Ia determinants on stimulated human T lymphocytes. J Exp Med 1979; 150: 246-55.

21) Judd W, Poodry CA, Strominger JL: Novel surface antigen expressed on dividing cells but absent from nondividing cells. J Exp Med 1980; 152: 1430–35.

22) Cebrian M, Yague E, Rincon M, Lopez-Botet M, Landazurl MO, Sanchez-Madrid E. Triggering of T-cell proliferation through AIM, an activation inducer molecule expressed on activated human lymphocytes. J Exp Med 1988; 168: 1621-37.

23) Fraser JD, Strauss D, Weiss A: Signal transduction events leading to T-cell lymphokine gene expression. Immunol Today 1993; 14: 357-62.

24) Caruso A, Licenziati S, Corulli M, et al. Flow cytometric analysis of activation markers on stimulated T cells and their correlation with cell proliferation. Cytometry 1997; 27: 71-6.

25) Demircan PC, Sariboyaci AE, Unal ZS, Gacar G, Subasi C, Karaoz E. Immunoregulatory effects of human dental pulp-derived stem cells on T cells: comparison of transwell coculture and mixedlymphocyte reaction systems. Cytotherapy 2011; 13: 1205-20.

26) Bitgen N, Altuntaş DH, Hamurcu Z, Demirtaş H, Ozturk F. Fitohemaglütinin ile uyarılmış insan T-lenfositlerindeki AgNOR motiflerinin T-lenfosit alt grupları ile karşılaştırmalı olarak incelenmesi. Erciyes Med J 2012; 34: 132-6.

27) Sariboyaci AE, Demircan PC, Gacar G, Unal ZS, Erman G, Karaoz E. Immunomodulatory properties of pancreatic islet-derived stem cells cocultured with T cells: Does it contribute to the pathogenesis of type 1 diabetes. Exp Clin Endocrinol Diabetes 2014; 122: 1-11.

28) Karaoz E, Demircan PC, Erman G, Güngörürler E, Sariboyacı AE. Comparative analyses of immune-suppressive characteristics of bonemarrow, Wharton's jelly and adiposetissue derived human MSCs. Turk J Hematol 2017; 34: 213-25.

29) Walling BL and Kim M. LFA-1 in T cell migration and differentiation. Front Immunol 2018; 9: 1-10.

30) Triebel F, DeRoquefeuil S, Blanc C, Charron DJ, Debre P. Expression of MHC class II and Tac antigens on IL-2 activated human T-cell clones that can stimulate in MLR, AMLR, PLT, and can present antigen. Human Immunol 1986; 15: 302-8.

31) Waldmann TA. The structure, function, and expression of interleukin-2 receptors on normal and malignant lymphocytes. Science 1986; 232: 727-32.

32) Siegal JP, Sharon M, Smith PL, Leonard WJ. The IL-2 receptor B chain (p70): Role in mediating signal for LAK, NK, and proliferative activities. Science 1987; 238: 75-8.

33) Nakamura S, Sung SSJ, Bjorndahl JM, Fu SM. Human T-cell activation IV. T-cell activation and proliferation via the early activation antigen EA-1. J Exp Med 1989; 169: 677-89.

34) Leroux M, Schindler L, Braun R, Doerr HW, Geissen HP, Kirchner H. A whole blood lymphoproliferation assay for measuring cellular immunity against herpes viruses. J Immunol Methods 1989; 79: 251-7.

35) Maino VC, Suni MA, Ruitenberg JJ. Rapid flow cytometric method for measuring lymphocyte subset activation. Cytometry 1995; 20: 127-33.

36) Krowka JF, Cuevas B, Maron DC, Steimer KS, Ascher MS, Sheppard HW. Expression of CD69 after in vitro stimulation: a rapid method for quantitating impaired lymphocyte responses in HIV-infected individuals. J Acquir Immune Defic Syndr 1996; 11: 95-104.

37) Sandoval-Montes C1, Santos-Argumedo L. CD38 is expressed selectively during the activation of a subset of mature T cells with reduced proliferation but improved potential to produce cytokines. J Leukoc Biol 2005; 77: 513-21.

38) Cooper David and Pellis NR. Suppressed PHA activation of T lymphocytes in simulated microgravity is restored by direct activation of protein kinase C. Journal of Leukocyte Biology 1998; 63: 550-62.

39) Pesoa S, Martín A, Mariani AL, Vullo C, Serra H. Interleukin 2 induction of proliferation in resting T lymphocytes requires contact with monocytes. Medicina (B Aires) 2000; 60: 202-10.

40) Bocharov1 G, Luzyanina T, Cupovic3 J, Burkhard L. Asymmetry of cell division in CFSE-based lymphocyte proliferation analysis. Front Immunol 2013; 4: 1-7.

41) Ahluwalia B, Magnusson MK, Isaksson S, Larsson F, Öhman L. Effects of Aloe barbadensis Mill. extract (AVH200®) on human blood T cell activity in vitro. J Ethnopharmacol 2016; 179: 301-9.