Anjiyotensinojen ve son ürünleri olan anjiyotensin I ve anjiyotensin II kan basıncının önemli düzenleyicileridir. Anjiyotensinojen için gen, AGT, iki yaygın tek nükleotid polimorfizmi ile karakterize olup T207M ve M268T’dir. Bu tek nükleotid polimorfizmler daha önceden T174M (Thr→Met, kodon 174’de) ve M235T (Met→Thr, kodon 235’de) olarak adlandırılmış ancak bu gösterim insan gen mutasyonu için bilimsel sınıflandırmaya uymamaktadır ve bu nedenle bizim yaptığımız çalışmada da T174M yerine T207M kullanılmıştır ⁷.

AGT polimorfizmleri; anjiyotensinojen düzeyleri ve hipertansiyonun genetik belirleyicileri olarak daha önceleri çalışılmış ancak çelişkili sonuçlar bulunmuştur ^8-10. Her ne kadar bu varyantlar RAS’nin kinetiğini değiştirdiği kanıtlanamamışsa da M268T’nin yüksek plazma AGT düzeyleri ile ilişkili olduğu bulunmuştur ⁵.

KKH sonucu oluşan Akut Miyokard İnfarktüsü (AMI) koroner arterlerin stenoz ve/veya oklüzyonunun bir sonucu olarak meydana gelir. Bu prosesin bir parçası olarak hemostatik sistemdeki bir anormallik trombozisi destekleyebilir ve böylece MI için bir risk oluşturabilir. Koagülasyon faktörlerinin aktivitesi; koroner arter hastalığı için önemli bir risk olup ^11,12, dolaşımdaki düzeyleri koagülasyon proteinlerin aktivitesini ve lokal konsantrasyonlarını kesin bir şekilde yansıtmaz, bunun nedeni de bu proteinlerin diyet, egzersiz ve ilaçlardan etkilenebilmesidir ^13,14. Protrombin (Faktör II) (G20210A) ve Faktör V (Faktör V Leiden, FVL)’in genetik varyantları venöz tromboz riskinde artış ile ilişkili olarak bulunmuştur ^15-17. Yapılan çalışmalarda; AMI için farklı risk faktörlerine sahip populasyonlarda; KAH için bir genetik predispozisyonun olduğu öne sürülmüştür ^18,19. Faktör II geninde (G20210A) ve Faktör V geninde (G1691A); glutamin aminoasidinin arjinin aminoasidi ile yer değiştirmesi sonucu nokta mutasyonlarını içeren genetik anomaliler saptanmıştır.

Bu çalışmada koroner arter hastalığının etyolojisini anlamak için anjiografik olarak koroner arter hastalığı tanısı alan hastalarda ve sağlıklı kontrollerde AGT T207M, Faktör V Leiden ve Faktör II (Protrombin) gen polimorfizmleri çalışılmış ve AGT gen polimorfizmi ile lipid profilleri arasındaki ilişkiyi saptamak amaçlanmıştır.

DNA izolasyonu
Çalışmaya dahil edilen bireylerden her iki EDTA’lı tüpe 2’şer ml kan alındı. Tüplerden biri hastaların DNA izolasyonlarını yapmak için kullanıldı. Tam kandan DNA izolasyonu DNA izolasyon kiti kullanılarak (High Pure PCR Template Preparation kit, Roche Diagnostic, Germany) yapıldı ve -20ºC’de saklandı. Diğer tüp ise 2500 rpm’ de 10 dakika santrifüj edilerek plazmaları ayrıldı. Plazma örneklerinde; Total Kolesterol, Trigliserid , HDL-Kolesterol ve LDLKolesterol düzeyleri Olympus AU 600 marka Otoanalizör cihazı kullanılarak (Olympus Optical Co Ltd, Japan) kendi ticari kit içeriğine uygun olarak tayin edildi.

Anjiotensinojen (T207M) gen polimorfizminin saptanması
AGT gen bölgesi için kullanılan primer dizileri: (5’ CAG GGT GCT GTC CAC ACT GGA CCC C 3’), (5’ CCG TTT GTG CAG GGC CTG GCT CTC T 3’) şeklindedir. Bireylere ait genomik DNA örneklerinde AGT lokusuna ait alleller polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile çoğaltıldı. AGT gen bölgesinin çoğaltılması için 94ºC’de 5 dakika başlangıç denatürasyonu, 95ºC de 1 dakika denatürasyon, 60ºC’de 1 dakika bağlanma ve 72ºC’de1 dakika uzama olmak üzere 30 döngüden oluşan bir PCR programı kullanıldı. PCR ile çoğaltılan AGT lokusuna ait fragman Nco1 restriksiyon endonükleaz ile kesilmiş ve daha sonra %1.5 luk agaroz jel elektroforezine tabi tutulmuştur. DNA fragmanları UV altında görüntülenip genotipleme yapılmıştır.

Protrombin (Faktör II) ve Faktör V Leiden gen mutasyonunun saptanması:
Gen mutasyonlarını belirlemek için LC Faktor V Leiden Mutation Detection (Roche Diagnostica, Katalog No:2212161) ve LC Protrombin (G20210A) Mutation Detection (Roche Diagnostica, Katalog No:2236842) kitleri kullanıldı. Protrombin geninin 165 bp fragmanı ile Faktör V geninin 222 bp fragmanı insan genomik DNA’sından sağlanan spesifik primerler ile amplifiye edildi. Reaksiyon karışımı (20l) insan genomik DNA’sı kullanılarak cam kapiller tüplerde hazırlandı ve real time PCR cihazı (Light Cycler, Roche Diagnostic, GmBh, Germany) kullanılarak ölçüldü.

İstatiksel Analiz
Bu çalışmanın istatiksel analizleri SPSS 10.0 istatistik paket programı kullanılarak yapılmış olup, P<0.05 olan değerler istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. Faktör II, V ve Anjiotensinojen gen polimorfizmlerinin genotip ve allellerin görülme sıklığının gruplar arası farklılıklarının değerlendirilmesinde χ² testi kullanılmıştır. Genotiplere göre lipid dağılımları için ANOVA testi, allellere göre lipid dağılımlarının belirlenmesi için ise student t testi kullanılmıştır.

Büyütmek İçin Tıklayın

Tablo 1: Hasta ve kontrol grubunu oluşturan bireylerin karakteristik özellikleri

Çalışma gruplarına ait AGT gen polimorfizminin genotip ve allel dağılımları AGT T207M gen polimorfizmlerinin frekansı TT için 0.74, TM için 0.15, MM için 0.12 olup hasta grubunda bu değerler TT için 0.84, TM için 0.14, MM için 0.02’dir. KKH’larında TT genotipinin frekansı kontrol grubuna göre yüksek olmasına rağmen (0.84 vs 0.74) bu değer istatiksel olarak anlamlı değildir (P>0.05) (Tablo 2).

Büyütmek İçin Tıklayın

Tablo 2: Hasta ve Kontrollerde AGT Genotipinin Dağılımı

AGT geninin T ve M allelerinini frekansları KKH’larında sırasıyla 0.91 ve 0.09, kontrol grubunda ise 0.81ve 0.19 olup hasta grubunda T alleli kontrol grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı olacak şekilde yüksek bulunmuştur (P<0.05) (Tablo 3).

Büyütmek İçin Tıklayın

Tablo 3: Hasta ve kontrol grubunda Anjiotensinojen gen polimorfizmi

Anjiotensinojen gen polimorfizmine göre plazma lipid düzeyleri
Lipid düzeylerinin Anjiotensinojen gen polimorfizmine göre saptanan değerleri ise Tablo 4’de verilmiştir. Plazma total kolesterol, LDL kolesterol ve trigliserid düzeyleri arasında ise istatiksel olarak anlamlı bir farklılık görülmemiştir.

Büyütmek İçin Tıklayın

Tablo 4: Plazma lipid düzeylerinin Anjiotensinojen gen polimorfizminin genotiplerine bağlı olarak değişimi

Allellere göre lipid dağılımı ise Tablo 5’de verilmiş olup plazma lipid düzeyleri ile AGT gen polimorfizminin allelleri arasında istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık bulunamamıştır.

Büyütmek İçin Tıklayın

Tablo 5: Plazma lipid düzeylerinin Anjiotensinojen gen polimorfizminin allellerine bağlı olarak değişimi

Faktör V Leiden ve Faktör II gen polimorfizmi
Çalışmamızda koroner kalp hastaları ve kontrol grubunda faktör II polimorfizmi için heterozigot olanların frekansı sırası ile %7.9, ve %5.3 olarak bulunmuştur. Bu frekans değerleri Faktör V Leiden için ise %13.2 ve %5.3 olarak bulunmuştur. (Tablo 6). Her iki polimorfizm için homozigot olan bireylere rastlanamamıştır. Koroner kalp hastaları ile kontrol grubu karşılaştırıldığında hem FV Leiden hem de Faktör II (Protrombin) açısından anlamlı bir farklılık saptanmamıştır.

Büyütmek İçin Tıklayın

Tablo 6: Protrombin (F II) ve Faktör V Leiden için heterozigot frekansları

Yapılan çalışmaların sonuçlarında da görüldüğü gibi angiotensinojen gen polimorfizminin sonuçları açısından çelişkili bilgiler bulunmuştur. Bu genetik çalışmalar arasındaki farklılığın etnik farklılıklar nedeniyle veya kontrol ve hasta grupları için farklı seçim kriterleri nedeni ile olabileceğini düşünmekteyiz.

Çalışmamızda plazma lipid düzeyleri ile T ve M allelleri arasında anlamlı bir ilişki gösterilememiştir. Ancak lipid düzeyleri ile AGT T207M polimorfizmi arasındaki ilişkiyi gösteren çalışmalar bulunmadığı için bu çalışma diğer çalışmalar ile karşılaştırılamamaktadır.

Faktör V ve Faktör II gen polimorfizmlerinin KKH ile ilişkisi:
Koagulasyon, hem intrensek hem de ekstrensek yolda bir seri reaksiyon ile etkileşime giren bir çok gen ürününü içerir ²⁹. Bu genlerdeki genetik anormallikler koagulasyon faktör proteinlerinde kantitatif bir artışa yol açarak tromboembolik olayların gelişimde artmış bir risk ile sonuçlanabilir ^12,17,19,30.

Protrombin ve Faktör V; tripsin ile homoloji gösteren bir serin proteaz bölge içerir. Protrombin; 21 kb’lık 14 ekzon içeren bir gen tarafından kodlanır ve hemostaz ve trombozisde anahtar bir rol oynar. Faktör V, Faktör Xa’yı etkileyerek protrombinin trombine dönüşümünün sağlayan tek zincirli bir glikoproteindir. Faktör V geninde 1691. pozisyonda bulunan adeninin guanin ile yer değiştirmesi sonucu tek bir baz değişikliği Faktör V Leiden mutasyonu olarak bilinir ve aminoasit sırasında (Arg-Gln) dönüşümü şeklinde bir değişiklikle sonuçlanır, bu da aktive protein C kompleksi tarafından degredasyona direnç oluşmasına yol açar ³¹. Bizim yaptığımız çalışmada FVL ve protrombin gen varyantı ile koroner arter hasalığı arasında bir ilişki gösterilememiştir. Her ne kadar her iki polimorfizmin frekansı koroner arter hastalarında daha yüksek bulunmuşsa da bu istatiksel olarak anlamlı değildir.

FVL mutasyonu otozomal dominant bir kalıtım gösterip etnik gruplar arasında FVL mutasyonu oldukça fazla heterojenite gösterir. Avrupalılar arasında yaygın, Asya ve Afrikalılar arasında ise daha ender görülmektedir ³². FVL için homozigot durumlar genç yaşdaki bireylerde venöz tromboembolizm için daha yüksek risk taşırken, FVL için heterozigotluk durumları tromboz riski genel populasyoa göre 7 kat daha fazla risk getirmektedir. Yapılan çeşitli çalışmalarda FVL ile koroner arter hastalığı arasındaki ilişki için çelişkili sonuçlar mevcuttur. Bazı çalışmalarda FVL taşıyıcılarında artmış risk bulunmuşken ^33,34, bazı çalışmalarda ise bir ilişki gösterilememiştir ^19,35,36

FII G20210A alleli sağlıklı beyaz bireylerde daha sık bulunmuşken Asya ve Afrikalılarda daha ender bulunmuştur. Yüksek protrombin düzeylerinin arteryal hastalıkların gelişimi için artmış bir risk taşıması biyolojik olarak mümkün görülmektedir ancak yapılan çalışmalar, FVL için olduğu gibi, 20210A protrombin alleli ile KAH arasındaki ilişkinin gösterilmesi açısından oldukça çelişkili sonuçlar vermiştir. Yapılan bazı çalışmalarda artmış risk bulunmuşken ^32,34 bazı çalışmalar da ise bir ilişki gösterilememiştir ^36-40

KAH ile bu iki polimorfizm arasındaki ilişkinin gösterildiği kafkas populasyonunda yapılan çalışmalarda bu genetik faktörlerin genel populasyona göre daha yüksek frekansda olması nedeni ile pozitif bir ilişki bulunmuş olabilir. Ayrıca, bu pozitif ilişki major kardiyovasküler risk faktörlerinin varlığı ile ilgili olup bu faktörler ile çevresel faktörler arasındaki ilişkiden kaynaklanıyor olabilir.

Sonuç olarak, bu çalışmadaki bulgularımız FVL mutasyonu ve protrombin gen mutasyonu ile KAH’na genetik yatkınlık arasında bir ilişki gösterilememiştir. FVL mutasyonu ve FII G20210A allelinin KAH’a yatkınlık yaratması konusunda yapılan çalışmalardaki farklı sonuçların nedeni genel populasyonda bu allelerin düşük frekansda bulunması olabilir.

1) Rigat B, Hubert C, Alhenc-Gelas F, Cambien F, Corvol P, Soubrier F. An insertion/deletion polymorphism in the angiotensin I-converting enzyme gene accounting for half the variance of serum enzyme levels. J Clin Invest.1990; 86: 1343- 1346.

2) Cambien F, Poirier O, Lecerf L, Evans A, Cambou JP, Arveiler D, Luc G, Bard JM, Bara L, Ricard S. et al. Deletion polymorphism in the gene for angiotensin-converting enzyme is a potent risk factor for myocardial infarction. Nature 1992; 359: 641– 644.

3) Russ AP, Maerz W, Ruzicka V, Stein U, Gross W. Rapid detection of the hypertension-associated Met235.Thr allele of the human angiotensinogen gene. Hum Mol Genet 1993; 2: 609–610.

4) Katsuya T, Koike G, Yee TW, Sharpe N, Jackson R, Norton R, et al. Association of angiotensinogen gene T235 variant with increased risk of coronary artery disease. Lancet 1995; 345: 1600–1603.

5) Ludwig EH, Borecki IB, Ellison RC, Folsom AR, Heiss G, Higgins M, et al. Associations between candidate loci angiotensin-converting enzyme and angiotensinogen with coronary heart disease and myocardial infarction: the NHLBI family heart study. Ann Epidemiol 1997; 7: 3–12.

6) Ko YL, Ko YS, Wang SM, Chu PH, Teng MS, Cheng NJ, et al. Angiotensinogen and angiotensin I converting enzyme gene polymorphisms and the risk of coronary artery disease in Chinese. Hum Genet 1997; 100: 210–214.

7) Antonarakis SE Recommendations for a nomenclature system for human gene mutations. Nomenclature Working Group. Hum Mutat 1998; 11: 1–3

8) Kunz R, Kreutz R, Beige J, Distler A, Sharma AM. Association between the angiotensinogen 235-T variant and essential hypertension in whites: a systematic review and methodological appraisal. Hypertension 1997; 30: 1331–1337

9) Jeunemaitre X, Gimenez-Roqueplo AP, Celerier J, Corvol P Angiotensinogen variants and human hypertension. Curr Hypertens Rep 1999; 1: 31–41

10) Wang JG, Staessen JA. Genetic polymorphisms in the reninangiotensin system: relevance for susceptibility to cardiovascular disease. Eur J Pharmacol 2000; 410: 289–302

11) Ruddock V, Meade TW. Factor VII activity and ischemic heart disease: fatal and non-fatal events. Q J Med 1994; 87: 403–406.

12) Meade TW, Mellows S, Brozovic M, Miller GJ, Chakrabarti RR, North WR, et al. Haemostatic function and ischemic heart disease: principal results of the Northwick Park Heart Study. Lancet. 1986;2:533–537.

13) De Boever E, De Bacquer D, Braeckman L, et al. Relation of fibrinogen to lifestyles and to cardiovascular risk factors in a working population. Int J Epidemiol. 1995; 24: 915–921.

14) Eliasson M. Asplund K, Evrin PE, Lundblad D. Relationship of cigarette smoking and snuff dipping to plasma fibrinogen, fibrinolytic varables and serum insulin: the Northern Sweden MONICA study. Atherosclerosis 1995; 113: 41–53.

15) Cumming AM, Keeney S, Salden A, Bhavnani M, Shwe KH, Hay CR. The prothrombin gene G20210A variant: prevalence in a U.K. anticoagulant clinic population. Br J Haematol 1997; 98: 353–355.

16) Martinelli I, Sacchi E, Landi G, Taioli E, Duca F, Mannucci PM. High risk of cerebral-vein thrombosis in carriers of a prothrombin-gene mutation and in users of oral contraceptives. N Engl J Med 1998.; 338: 1793–1797.

17) Bertina RM. Factor V Leiden and other coagulation factor mutations affecting thrombotic risk. Clin Chem 1997; 43: 1678– 1683.

18) de Maat MPM, Green F, de Knijff P, Jespersen J, Kluft C. Factor VII polymorphisms in populations with different risk of cardiovascular disease. ArteriosclerThrombVasc Biol. 1997; 17: 1918–1923.

19) Ridker PM, Hennekens CH, Lindpaintner K, Stampfer MJ, Eisenberg PR, Miletich JP. Mutation in the gene coding for coagulation factor V and the risk of myocardial infarction, stroke, and venous thrombosis in apparently healthy men. N Engl J Med. 1995; 332: 912–917.

20) Powell JS, Clozel JP, Muller RK, Kuhn H, Hefti F, Hosang M, et al. Inhibitors of angiotensin-converting enzyme prevent myointimal proliferation after vascular injury. Sciencem 1989; 245: 186–8.

21) Chobanian AV, Haudenschild CC, Nickerson C, Drago R. Antiatherogenic effect of captopril in the Watanabe heritable hyperlipidemic rabbit. Hypertension 1990; 15: 327–31.

22) Aberg G, Ferrer P. Effects of captopril on atherosclerosis in cyomolgus monkeys. Cardiovasc Pharmacol 1990; 15(Suppl 15): S65–S72.

23) Wang DH, Prewitt RL. Captopril reduces aortic and microvascular growth in hypertensive and normotensive rats. Hypertension 1990; 15: 68–77.

24) Tiret L, Ricard S, Poirier O, Arveiler D, Cambou JP, Luc G, et al. Genetic variation at the angiotensinogen locus in relation to high blood pressure and myocardial infarction. J Hypertens 1995;13:311–7.

25) Caulfield M, Lavender P, Newell-Price J, Farrall M, Kamdar S, Daniel H, et al. Linkage of the angiotensinogen gene locus to human essential hypertension in African Caribbeans. J. Clin. Invest. 1995; 96: 687–692.

26) Nair KG, Shalia KK, Ashavaid TF, Dalal JJ. Coronary Heart Disease, Hypertension, and Angiotensinogen Gene Variants in Indian Population. J Clin Lab Anal. 2003; 17: 141–146

27) Ko YL, Ko YS, Wang SM, Chu PH, Teng MS, Cheng NJ, et al. Angiotensinogen and angiotensin-I converting enzyme gene polymorphisms and the risk of coronary artery disease in Chinese. Hum Genet 1997;100: 210–214

28) Gardemann A, Stricker J, Humme J, Nguyen Q , Katz N, Philipp M, et al. Angiotensinogen T174M and M235T gene polymorphisms are associated with the extent of coronary atherosclerosis. Atherosclerosis 1999; 145 309–314

29) Davie EW. Biochemical and molecular aspects of the coagulation cascade. Thromb Haemost 1995; 74: 1–6

30) Simioni P, Prandoni P, Lensing AW, Scudeller A, Sardella C, Prins MH, et al. The risk of recurrent venous thromboembolism in patients with an arg 506gln mutation in the gene for factor V (factor V leiden). N Engl J Med 1997; 336: 399–403.

31) Bertina RM, Koeleman BP, Koster T, Rosendaal FR, Dirven RJ, de Ronde H, et al. Mutation in blood coagulation factor V associated with resistance to activated protein C. Nature 1994; 369: 64–67.

32) Rees DC, Cox M, Clegg JB. World distribution of factor V Leiden. Lancet 1995; 346: 1133-1134.

33) Rosendaal FR, Siscovick DS, Schwartz SM, Beverly RK, Psaty BM, Longstreth WT, et al. Factor V Leiden (resistance to activated protein C) increases the risk of myocardial infarction in young women. Blood 1997; 89: 2817-21

34) Mansourati J, Da Costa A, Munier S, Mercier B, Tardy B, Ferec C, et al. Prevalence of factor V Leiden in patients with myocardial infarction and normal coronary angiography. Thromb Haemost 2000; 83: 822-825.

35) Cushman M, Rosendaal FR, Psaty BM, Cook EF, Valliere J, Kuller LH, et al. Factor V Leiden is not a risk factor for arterial vascular disease in the elderly: results from the Cardiovascular Health Study. Thromb Haemost 1998; 79: 912-915.

36) Juul K, Tybjaerg-Hansen A, Steffensen R, Kofoed S, Jensen G, Nordestgaard BG. Factor V Leiden: The Copenhagen City Heart Study and 2 meta-analyses. Blood 2002; 100: 3-10.

37) Corral J, Gonzalez-Conejero R, Lozano ML, Rivera J, Heras I, Vicente V. The venous thrombosis risk factor 20210 A allele of the prothrombin gene is not a major risk factor for arterial thrombotic disease. Br J Haematol 1997; 99: 304-307

38) Russo C, Girelli D, Olivieri O, Guarini P, Manzato F, Pizzolo F, et al. G20210A prothrombin gene polymorphism and prothrombin activity in subjects with or without angiographically documented coronary artery disease. Circulation 2001; 103: 2436-40.

39) Coulet F, Godard V, Verdy E, Soubrier F. Lack of association of the prothrombin gene variant G20210A with myocardial infarction in Caucasian males. Thromb Haemost 2000; 83: 796-7.

40) Croft SA, Daly ME, Steeds RP, Channer KS, Samani NJ, Hampton KK. The prothrombin 20210A allele and its association with myocardial infarction. Thromb Haemost 1999; 81: 861-4.