Çalışmamız, Fırat Üniversitesi Tıp Fakültesi Etik Kurul
onayı alındıktan sonra, Fırat Üniversitesi Tıp Fakültesi
Kalp ve Damar Cerrahisi ve Patoloji Anabilim Dalları
tarafından gerçekleştirildi. Yapılacak çalışma hastalara
anlatılarak Helsinki Deklarasyonu prensiplerine uygun
olarak yapıldı. Çalışma, Fırat Üniversitesi Bilimsel
Araştırma Proje Merkezi tarafından desteklendi.
Çalışmaya her iki cinsten, koroner arter bypass
greft operasyonu geçirecek varis ve venöz yetmezlik
tanısı almamış, sağlıklı vena safena magna (VSM)’ya
sahip 32 hasta alındı. Hastalar 8’erli 4 gruba ayrıldı.
Gruplar:
Grup 1 (Kontrol grubu): Safen veni heparinli serum
fizyolojik solüsyonu (300 cc %0.9 NaCl içine
5000 Ü heparin konularak hazırlanan solüsyon) ile 100
mmHg basınçla 2 dakika süre ile şişirildi, ardından bir
saat süre ile aynı solüsyonda bekletildi..
Grup 2 (Papaverin grubu): Safen veni papaverinli
serum fizyolojik solüsyonu (300 cc %0.9 NaCl
heparinli serum fizyolojik solüsyonu içine 20 mg
papaverin -Papaverin amp 40mg/2ml- konularak hazırlanan
solüsyon) ile100 mmHg basınçla 2 dakika süre
ile şişirildi, ardından bir saat süre ile aynı solüsyonda
bekletildi.
Grup 3 (Verapamil grubu): Safen veni
Verapamilli serum fizyolojik solüsyonu (300 cc %0.9
NaCl heparinli serum fizyolojik içine 5 mg verapamil -
İsoptin amp 5mg/2ml- konularak hazırlanan solüsyon) ile 100 mg basınçla 2 dakika süre ile şişirildi, ardından
bir saat süre ile aynı solüsyonda bekletildi.
Grup 4 (Nitrogliserin grubu): Safen veni nitrogliserinli
serum fizyolojik solüsyonu (300 cc %0.9 NaCl
heparinli serum fizyolojik solüsyonu içine 2.5 mg nitrogliserin
(Perlinganit amp 10mg/10ml) konularak
hazırlanan solüsyon) ile100 mmHg basınçla 2 dakika
süre ile şişirildi, ardından bir saat süre ile aynı solüsyonda
bekletildi.
Damar Örneklerinin Alınması-Hazırlanması:
Koroner bypass operasyonu için aynı cerrahi ekip
tarafından hazırlanan VSM greftlerinden 5’er cm’lik
safen ven parçalarının distal uçları bağlanıp proksimal
uçları kanüle edildi. Safen venler hazırlanan solüsyonlarla
üçlü musluğun bir ucundan 20 cc’lik enjektörle
ortalama 100 mmHg basınçta şişirildi. Bu işlem üçlü
musluğun diğer ucundan yerleştirilen transdüser aracılığıyla
monitörize edildi (Resim 1). Mütakiben her bir
vena safena magnadan yaklaşık 2 cm doku örneği alındı.
Alınan doku örnekleri %10’luk formaldehitte tespit
edildikten sonra parafin bloklara gömüldü.
Histomorfolojik İnceleme:
Histomorfolojik ve immunohistokimyasal incelemelerin
hepsi aynı patolog tarafından yapıldı. Hazırlanan
parafin bloklardan mikrotom ile 4 μm kalınlığında
kesitler alındı. Alınan kesitler deparafinize edilerek
cam slaytlara monte edilip hematoksilen-eozin,
Verhoeff’un Elastik boyası ve Masson Trichrome
kollajen boyası ile boyandı. Işık mikroskobisinde ven
duvar katmanlarının yapısal düzeni ve hücre dizilimleriyle
birlikte kollajen ve elastin içerikteki patolojik
değişiklikler değerlendirildi.
İmmunohistokimyasal İnceleme:
Hazırlanan parafin bloklardan elde edilen 4μm
kalınlığındaki kesitlere avidin-biotin-peroksidaz yöntemi
ile immunohistokimyasal olarak bax, bcl-2 ve
kaspaz-9 uygulandı. Kesitler bax, bcl-2 için
deparafinize ve rehidrate edildikten sonra endojen peroksidaz aktivitesini bloke etmek maksadıyla 5 dk.
%3 hidrojen peroksitte tutuldu. Daha sonra distile su ile
yıkanıp pH 6’da 650 mw (mikrodalga)’da sitrat
buffer’da 5 dakika bekletildi. Kesitlere 10 dk Ultra V
blok uygulandı. Kaspaz-9 için deparafinize ve rehidrate
edildikten sonra 10 dakika pepsin enzimi uygulandı ve
distile su ile yıkanıp 5 dk. %3 hidrojen peroksitte tutuldu.
Daha sonra benmaride 37°C nemli ortamda 30 dk
süreyle mouse monoclonal antibody Bax (Neomakers,
Fremont, CA, USA), mouse monoclonal antibody Bcl-
2 (Neomakers, Fremont, CA, USA), rabbit polyclonal
antibody Kaspaz-9 (Neomakers, Fremont,CA,USA)
antikorları uygulandı. Ardından 0,001 M, pH 7.4 olan
PBS ile yıkanarak avidin- biotin peroksidaz ile inkübe
edildi. AEC kromojen ile boyandı. Bütün kesitlere
Mayer Hematoksileni ile zıt boyama yapıldı ve özel
kapatma maddesi (Ultra Mount Medium) ile kapatıldı.
İmmünohistokimyasal inceleme Enrico Ascher ve
arkadaşlarının7 yöntemine göre yapıldı. Işık
mikroskobisinde (Olympus model U-MDOB, Japan) ×
400 büyütmede her kesitten rastgele 10 saha incelendi.
Her sahadaki 100 hücreden bax (+), bcl-2 (+) ve
kaspaz-9 (+) olanlar sayıldı. Toplam boyanan hücrelerin
ortalama yüzdeleri alındı.
İstatiksel Analiz:
İstatistiksel değerlendirmeler için Statistical
Programme Software System (SPSS) 15.0 programı
kullanıldı. Elde edilen veriler ortalama ± standart
deviasyon olarak gösterildi. Gruplar arası farkın değerlendirilmesinde,
“tek yönlü varyans analizi (one-way
ANOVA)” ve Post Hoc test olarakta “Tukey HSD
(honestly significant difference) test” kullanıldı.
p<0.05 olan değerler anlamlı olarak kabul edildi.