DIBP, plastik malzemelere esneklik ve dayanıklılık kazandırmak amacıyla kullanılan sentetik bir bileşiktir ³. DIBP’nin plastik polimer matriksine kovalent bağlarla bağlanmadığı için çevreye kolayca salınabildiği ve bu nedenle Amerika Birleşik Devletleri tarafından öncelikli bir çevresel kirletici olarak tanımlandığı bildirilmiştir ⁴. Yüz maskesi, oje ve saç spreyi gibi kozmetik ürünler, kan torbaları ve katater gibi tıbbi malzemeler, çatal ve bıçak gibi metal ürünler, eldiven, cüzdan ve ayakkabı gibi deri ürünleri, gıda ambalajları ve saklama kapları DIBP içerirler ^3,5-8.

Geniş kullanım alanlarından dolayı fitalatlara oral, inhalasyon ve dermal yollarla maruz kalınabilmektedir ⁹. Yapılan çalışmalarda DIBP ve metabolitine (Mono-izobutil fitalat, MiBP) maruziyetin DBP gibi fitalatlara alternatif olarak kullanılması nedeniyle arttığı gösterilmiştir ¹⁰. Günümüzde MiBP idrar, anne sütü ve amniyotik sıvı gibi birçok biyolojik sıvıda tespit edilmiştir ^11,12. Birçok sistem üzerine toksik etkisi olan fitalatların en önemli etkisi reprodüktif sistem üzerinedir ¹³. Bununla birlikte yapılan çalışmalarda fitalatların immun sistem üzerinde de önemli etkileri olabileceği gösterilmiştir. Linghu ve ark. ¹⁴, 5-6 haftalık erkek ratlarda 50 mg/kg ve 100 mg/kg dozunda DEHP’e maruz kalmanın kan total lenfosit, monosit, nötrofil, eozinofil ve bazofil sayılarında azalmaya neden olduğunu bildirmişlerdir. Pierozan ve ark. ¹⁵ sekiz haftalık erkek farelere düşük (10 mg/kg/gün) ve yüksek dozlarda (100 mg/kg/gün) DBP uygulamasının total lökosit sayısı ile birlikte monosit ve yardımcı T lenfosit sayısında azalmaya neden olarak enfeksiyon hastalıkları ve kansere duyarlılığı artırırken aşı etkinliğini de azaltabileceğini bildirmişlerdir.

Asit fosfataz, asit hidrolazlar grubunda bulunan lizozomal karakterde bir enzimdir. Asit fosfataz enzimi miyelositler, polimorf nükleer lökositler, lenfositler, plazma hücreleri, megakaryositler, kan pulcukları ve mononükleer fagositik sistem hücrelerinde bulunmaktadır ^16,17. Perifer kan lenfositleri granüler tarzda ACP-az enzim pozitivitesi gösterirken, monositler ise sitoplazmalarında ince granüllerden oluşan diffuz pozitiviteye sahiptirler ¹⁸. ACP-az enziminin memelilerde T-lenfositlere özgü olduğu ileri sürülürken ¹⁹, tavuklarda B-lenfositlere özgü olduğu bildirilmiştir ²⁰.

Günümüzde çörek otu veya siyah kimyon olarak bilinen Nigella sativa tohumu birçok kültürde geleneksel olarak çeşitli tıbbi faydaları için kullanılmaktadır ²¹. Nigella sativa tohumlarının biyolojik etkilerinin büyük çoğunluğu ise tohumların %30-48' ini oluşturan yağ bileşenlerine atfedilmiştir. Amerika Birleşik Devletleri Gıda ve İlaç Dairesi (Food and Drug Administration-FDA), siyah kimyon yağını "Genel Olarak Güvenli Olarak Kabul Edilir" olarak etiketlemiştir ^22,23. Timokinon (2-izopropil-5-metil-1,4-benzokinon), Nigella sativa yağında ve özütlerinde bulunan önemli bir fitokimyasal biyoaktif bileşendir ^24,25. Terapötik bir ajan olarak kullanıldığı çalışmalarda timokinonun antihistaminik, antiinflamatuar, antihipertansif, hipoglisemik, antikanser ve bağışıklık güçlendirici etkilerine dikkat çekilmiştir ^26-28.

Bu çalışmada, ratlarda DIBP maruziyetinin perifer kan lökosit sayısı ile lenfosit ve ACP-az pozitif lenfositler üzerine etkisi ve timokinonun koruyucu rolünün belirlenmesi amaçlanmıştır.

Bu çalışma, Selçuk Üniversitesi Veteriner Fakültesi Deney Hayvanları Üretim ve Araştırma Merkezi Etik Kurulu (SÜVDAMEK)’nun 2024/184 sayılı onayı ile gerçekleştirildi.

Hayvan Materyali ve Deney Gruplarının Tasarımı

Çalışmada toplam 50 adet 4 haftalık Wistar Albino erkek ratlar kullanıldı. Ratların bakımı standart laboratuvar hayvanlarının bakım şartlarına (12 saat aydınlık-12 saat karanlık ve 21±1 °C) uygun olarak gerçekleştirildi. Deneysel uygulamalar süresince ratlara standart ticari yem (pelet yem) ve su adlibitum olarak sağlandı.

Hayvanlar rastgele 7 gruba ayrıldı.

Kontrol grubu (n =6): Bu gruptaki ratlara herhangi bir uygulama yapılmadı.

Taşıyıcı Kontrol grubu (n =6): Bu gruptaki ratlara 30 gün süre ile günde bir defa oral gavaj yoluyla mısır yağı verildi.

500 mg/kg DIBP grubu (n =8): Bu gruptaki ratlara 30 gün süre ile günde bir defa oral gavaj yoluyla mısır yağı içerisinde 500 mg/kg dozunda DIBP verildi.

750 mg/kg DIBP grubu (n =8): Bu gruptaki ratlara 30 gün süre ile günde bir defa oral gavaj yoluyla ile mısır yağı içerisinde 750 mg/kg dozunda DIBP verildi.

Timokinon grubu (n =6): Bu gruptaki ratlara 30 gün süre ile günde bir defa oral gavaj yoluyla mısır yağı içerisinde 10 mg/kg dozunda timokinon verildi.

500 mg/kg DIBP + Timokinon grubu (n =8): Bu gruptaki ratlara 30 gün süre ile oral gavaj yoluyla günde bir defa mısır yağı içerisinde 500 mg/kg dozda DIBP+10 mg/kg timokinon veridi.

750 mg/kg DIBP + Timokinon grubu (n =8): Bu gruptaki ratlara 30 gün süre ile oral gavaj yoluyla günde bir defa mısır yağı içerisinde 750 mg/kg dozda DIBP+10 mg/kg timokinon verildi.

Otuz günlük deneme süresinin sonunda bütün hayvanlardan antikoagulanlı tüplere kan örnekleri alındı. Kan örneklerinden otomatik hücre sayım cihazıyla (Abbot Architech 3700 model analizör) lökosit sayısı ve total lenfosit (%) belirlendi. Ayrıca alınan kan örneklerinden 2’şer adet froti hazırlandı. Ortam sıcaklığında kurutulan frotiler -10 °C’ deki glutaraldehid-aseton tespit solüsyonunda (pH:4.8) 3 dakika süreyle tespit edildi. Frotiler ACP-az enzim demonstrasyonu için inkübasyon solüsyonunda inkübe edildi. İnkübasyon sonunda 3’er defa distile su ile yıkanan preparatlara, asetat tamponunda (pH:4.8) hazırlanmış olan %1’ lik methyl- green ile çekirdek boyası uygulandı ²⁹. Enzim demonstrasyonu yapılan kan preparatlarının her birinde toplam 200 adet lenfosit ışık mikroskobunda (DFC- 320 model kamera ataçmanı olan Leica DM-2500) sayılarak ACP-az pozitif lenfosit oranları yüzde olarak belirlendi.

İstatistiksel Analiz

Tüm verilerin istatistiksel analizi için SPSS 25 (IBM SPSS Statistics for Windows, Sürüm 25.0. Armonk, NY: IBM Corp, 2017) paket programı kullanıldı. Ölçümlerden elde edilen sayısal veriler One-Way Anova Testi (Tek Yönlü Varyans Analizi) ve ardından çoklu karşılaştırma testlerinden Duncan testiyle analiz edilerek grupların ortalama değerleri arasındaki farkların önem dereceleri belirlendi. Tüm veriler ortalama±standart sapma (SD) olarak sunuldu. Testlerin anlamlılık düzeyi p <0.05 olarak belirlendi.

Tablo 1: Perifer kanda lökosit sayısı, lenfosit ve ACP-az pozitif lenfosit oranları (%). abc Aynı sütunda farklı harf taşıyan gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılık vardır (p <0.05).

Frotiler üzerinde yapılan ışık mikroskobik incelemeler sonucunda lenfositlerdeki ACP-az pozitivitesinin 1-3 adet pembe-kırmızı granül şeklinde olduğu dikkati çekti (Şekil 1).

Şekil 1: Perifer kan frotisinde ACP-az demonstrasyonu. Ok: ACP-az pozitif lenfosit. Ok başı: ACP-az negatif lenfosit. Bar: 20 µm.

Perifer kan ACP-az pozitif lenfosit oranlarının 500 ve 750 mg/kg DIBP gruplarında diğer gruplarla karşılaştırıldığında istatistiksel olarak önemli oranda (p <0.05) düşük olduğu tespit edildi. DIBP ile birlikte timokinon uygulanan gruplarda bu değerin sadece DIBP uygulanan gruplara göre bir miktar arttığı görüldü (Tablo 1).

İnsan ve hayvanlarda çevresel kimyasallara maruziyetin artış göstermesi ve immun sistemle ilişkili hastalıkların görülme sıklığı arasında önemli bir korelasyon olduğu bildirilmiştir ^35,37. Endokrin bozucu kimyasallar olarak bilinen fitalatların da immun sistemi etkileyeceği düşünülerek çeşitli fitalat türlerinin immun sistem üzerindeki etkilerini araştıran çok sayıda çalışma yapılmıştır ^14,38. Yetişkin erkek farelerde yapılan bir çalışmada, 5 hafta boyunca 10 ve 100 mg/kg dozlarında oral DBP uygulanmasının lökosit, monosit ve yardımcı T lenfosit popülasyonunu azaltarak immünosupresyona neden olabileceği rapor edilmiştir ¹⁵. Benzer şekilde Linghu ve ark. ¹⁴ 5-6 haftalık erkek ratlara 50 mg/kg ve 100 mg/kg dozunda DEHP uygulamasının total lenfosit, monosit, nötrofil, eozinofil ve bazofil sayısında düşüşe yol açtığını bildirmişlerdir. Dahası bu çalışmada, CD3⁺ ve CD4⁺ yardımcı T lenfositlerin azalmasına bağlı olarak mast hücreleri ve eozinofillerin proliferasyonunu sağlayan sitokinlerin azaldığı ve ayrıca lenfositlerde apoptoz ve nekroza sebep olan bazı genlerin ekspresyonunun arttığı bildirilmiştir.

Daha düşük molekül ağırlıklı fitalatlardan biri olan DMP üzerine yapılan bir çalışmada ise Chi ve ark. ³⁹ 6 haftalık Sprague Dawley erkek ratlara 0, 50, 250 ve 500 mg/kg dozlarında DMP uygulanmıştır. Bu çalışmada DMP’nin antioksidan aktiviteyi inhibe ettiği, reaktif oksijen türlerini (ROS) arttırdığı ve böylece oksidatif strese yol açtığı tespit edilmiştir. Araştırıcılar DMP uygulanan gruplarda eritrosit, lökosit ve lenfosit sayısında belirgin azalma olduğunu bildirmişler ve kan hücrelerindeki değişikliklerin DMP’ nin kemik iliğinde kan hücrelerinin maturasyonu üzerinde bir etkisi olabileceğini ileri sürmüşlerdir. Gebeliğin farklı dönemlerinde siyah Bengal keçisine DEP, DBP, DIBP ve DPP olmak üzere dört farklı fitalat karışımı rasyonla birlikte verilmiş ve hematolojik parametreler incelenmiştir. Çalışmada eritrosit ve lökosit sayısı, hemoglobin konsantrasyonu, hematokrit değerleri fitalata maruz kalan keçilerde anlamlı düzeyde daha düşük bulunmuştur ⁴⁰. Kiran ve ark. ⁴¹ ratlara iki hafta 50 mg/kg dozunda DBP uygulamasının hemoglobin konsantrasyonu ve eritrosit sayısında önemli bir azalmaya neden olduğunu, benzer şekilde Patel ve ark. ⁴² DBP uygulamasının da lökosit ve eritrosit sayısı ile hemoglobin, hematokrit, MCV ve MCHC değerlerinde önemli bir azalmaya neden olduğunu bildirmişlerdir. Dişi albino farelerde DEHP toksisitesinin hematolojik ve biyokimyasal parametreler üzerindeki etkisinin incelendiği bir çalışmada glikoz, trigliserid, düşük yoğunluklu lipoprotein ve toplam protein düzeylerinin belirgin şekilde artmış olduğu; toplam alyuvar ve akyuvar sayısı ile hemoglobin düzeyinin ise kontrol grubuna kıyasla anlamlı şekilde azaldığı gözlenmiştir ⁴³. Baralić ve ark. ⁴⁴ ratlarda DEHP, DBP, BPA’yı ayrı ayrı ve hepsinin karışımı halinde vermişler ve bu gruplarda kontrol grubuna kıyasla lökosit ve lenfosit sayısında önemli bir artış olduğunu bildirmişlerdir.

ACP-az enziminin memelilerde çoğunluğunu T-lenfositlerinin oluşturduğu hücre popülasyonları için spesifik olduğu bildirilmiştir ⁴⁵. Enzim histokimyasal teknikler, insan ve çeşitli hayvan türlerinin bağışıklık sistemleri üzerinde yapılan deneysel çalışmaların yanı sıra bazı hastalıkların teşhisinde ve sınıflandırılmasında sıklıkla kullanılmaktadır. Bu sebeple kan hücrelerinin sayı ve oranlarının ayrıca kan hücrelerinden özellikle lenfositlerin enzimatik özelliklerinin belirlenmesi önem kazanmaktadır. DIBP maruziyetinde kanda ACP-az (+) lenfosit oranlarındaki değişiklikler, fitalatların immün sistem üzerindeki olası etkilerini açıklamada önemli ipuçları sağlayabilir. Bu çalışmada lenfosit ve ACP-az pozitif lenfosit oranlarının 500 mg/kg ve 750 mg/kg DIBP uygulanan gruplarda diğer gruplara göre istatistiksel olarak anlamlı düzeyde azaldığı dikkati çekti (p< 0.05). 500 mg/kg DIBP + timokinon ve 750 mg/kg DIBP + timokinon gruplarında da lenfosit ve ACP-az pozitif lenfosit oranları ise sadece DIBP uygulanan gruplara göre bir miktar artış gösterdi.

Timokinon (2-metil-5-izopropil-1,4-benzokinon), çörek otu olarak da bilinen Nigella sativa' dan (N. Sativa) elde edilen biyoaktif bir bileşendir. N. Sativa, besin açısından zengin değerli tıbbi bitkilerden biridir ⁴⁶. Antioksidan, anti-inflamatuar, antimikrobiyal, antidiyabetik ve antineoplastik etkilerinin yanı sıra timokinon güçlü bir immünomodülatördür ^47,48. Yetişkin erkek ratlarda timokinon’un imidakloprid kaynaklı immünotoksisite üzerindeki etkisinin araştırıldığı bir çalışmada, 7 gün boyunca 1 mg/kg dozunda uygulanan timokinon takviyesinin fagositik aktiviteyi, kemotaksiyi, immünoglobulin seviyeleri ve antikorların hemaglütinasyonunu artırdığı tespit edilmiştir. ⁴⁹. Ratlarda 4 hafta boyunca 2.5, 5 ve 10 mg/kg dozlarında uygulanan timokinonun, diazinonun immun sistem üzerindeki toksik etkisini azalttığı bildirilmiştir ⁵⁰. Yüksel ve ark. ⁵¹ siklofosfamidin sitotoksik ve genotoksik etkilerine karşı timokinonun koruyucu etkisini değerlendirdikleri çalışmada timokinon’ un genotoksik hasara karşı insan periferik kan lenfosit kültürleri üzerinde in vitro koruyucu bir etkiye sahip olduğunu rapor etmişlerdir. Neonatal ratlarda aflatoksin M1 (AFM1) kaynaklı hematotoksisite ve hepatotoksisiteye karşı timokinon uygulamasının koruyucu etkinliğe sahip olduğu bildirilmiştir ⁵². Benzer şekilde ratlarda bisfenol-A (BPA)’ nın neden olduğu hematotoksisiteye karşı da timokinonun koruyucu etkinliğinin olduğu ortaya konulmuştur ⁵³.