Melatonin (N-acetyl-5-methoxytryptamine ) esansiyel bir aminoasit olan triptofandan elde edilen ve pineal bez, over, retina ve gastrointestinal sistem organlarından üretilen en önemli indolamindir. Birçok yararlı etkiye sahip olan melatonin, direkt olarak serbest radikal süpürücüsüdür ve bu etkisiyle bilinen tüm antioksidanlardan daha güçlüdür ¹⁰. İndirekt etkiyle de melatonin reseptörleri sayesinde antioksidan enzim seviyelerini artırarak ya da pro-oksidatif enzimleri inhibe ederek doku koruyucu özellik gösterir ^11,12. Aynı zamanda oksidatif stres altındaki antioksidan enzim aktivitesini de değiştirdiği birçok araştırmayla gösterilmiştir ^10,13.

Oksijen radikallerinin miyokarddaki toksik etkileri saptanmış ve bu durumda primer savunma mekanizmasının endojen antioksidanlar olduğu da gösterilmiştir ^11,12. Ayrıca kalp kası hücrelerinde melatonin reseptörleri saptanmış ancak biyolojik önemi henüz tam olarak açıklanamamıştır ¹⁴. Bugüne kadar CyA kardiyotoksitesinde antioksidanların korucu etkisini araştıran fazla çalışma yoktur. Melatoninin CyA’ya bağlı kardiak toksitedeki etkisi sadece Rezzani ve arkadaşları tarafından 2006 yılında yayınlanan bir makale ile araştırıcılara sunulmuştur ¹⁰.

Çalışmamızdaki amacımız; sıçanlarda deneysel olarak CyA’ya bağlı kardiyotoksite oluşturulduktan sonra, verilecek intraperitoneal melatoninin CyA’nın olumsuz etkilerini azaltıp azaltmadığını saptamaktır.

Gruplarımız şöyleydi;
Grup 1;Kontrol grubu
Grup 2; İntraperitoneal (i.p.) 4mg/kg/gün melatonin uygulanan grup.
Grup 3; subkutan (s.c.) 10 mg/kg/gün siklosporin A (sandimmun 50 mg/ml ampul Novartis Pharma AG, Basel, İsviçre) uygulanan grup.
Grup 4; 4mg/kg/gün i.p. melatonin ve s.c. 10 mg/kg/gün CyA uygulanan grup.

Preparatlar iki histolog tarafından körlemesine incelendi ve histopatolojik değişiklikler aşağıdaki gibi derecelendirildi:

Her gruptan 100 adet kalp hücresi sayılarak nukleus yerleşimleri ve sarkoplazmik vakuolizasyonları değerlendirildi. Buna göre periferik nukleus 1-10 hücrede görüldüğünde hafif, 11-20 hücrede orta, 21 ve üzeri hücrede görüldüğünde ise şiddetli derecede kalp hasarı düşünüldü. Sarkoplazmik vakuolizasyon açısından da aynı hücre sayıları göz önüne alınıp derecelendirildi. Her denekte 10 alan sayılarak da hücre infiltrasyonu, stromal fibrozis ve koagülasyon nekrozu değerlendirildi. Hücre infiltrasyonuna 0=hiç yok, 1 alanda rastlanması=hafif, 2 alan=orta, 3 alanda rastlanması ise=şiddetli infiltrasyon olarak derecelendirildi. Stromal fibrozis ve koagülasyon nekrozu açısından da 0=hiç yok, 1 alanda =hafif, 2 alanda=orta ve 3 alanda saptanması=yaygın stromal fibrozis veya koagülasyon nekrozu olduğunu düşündürdü (Tablo 1).

Tablo 1: Gruplara ait histolojik değerlendirmeler

Tüm istatistiksel analizler SPSS 12.0 paket programı kullanılarak yapıldı. Gruplar arası karşılaştırmalarda Mann-Whitney U testi kullanıldı ve tüm analizlerde p< 0. 05 değerleri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

Kontrol grubunda inceleme yapıldığında; yoğun kas fibrilleri ve az miktardaki bağ dokusuyla normal kalp dokusu izlendi. Kas fibrilleri bol sarkoplazmalı hücresel ünitelerden oluşuyordu. Hücreler bir veya iki uçlarından yan dallar vermişlerdi. Her hücrede tek olan oval şekilli nukleusların yerleşimi merkeziydi. Bağ dokusu oldukça ince ve şeffaf izleniyordu. Grup 2;Melatonin verilen grupta bütün alanlar normal kalp histolojisiyle uyumluydu. Grup 3; CyA ile tedavi edilen grupta histopatolojik değişiklikler söz konusuydu. Kalp kası tabakası ve yaptıkları ağ düzensiz izleniyordu. Buradaki kas fibrilleri kontrol grubuna benzer şekilde sarkoplazmadan zengin görünüyordu ancak, nukleus yerleşimi merkezi değildi. Bazı alanlarda hücre bütünlüğünün bozulmaya başladığı, sarkoplazmada parçalanmaların ve vakuolizasyonların geliştiği dikkatimizden kaçmadı (Şekil 1). İncelediğimiz materyalde bol miktarda hücre infiltrasyonu söz konusuydu. Yer yer kalbe ait bağ dokusu artmıştı ve özellikle kardiyak fibrillerin etrafında ve damar çevrelerinde fibrozis izleniyordu (Şekil 1,2). Bu grupta gözlemlediğimiz bir diğer bulgu ise küçük çaplı hemorajik alanların varlığıydı (Şekil 3). Grup 4; CyA ile birlikte melatonin verilen grupta ise genelde kontrol grubuna benzer yapı görülürken, çok az alanda hücre infiltrasyonu ve stromal fibrozisin devam ettiği gözlemlendi (Şekil 4, 5).

Şekil 1: CyA alan grupta kalp dokusu kesitleri. Nukleslar periferik yerleşmiş. Hücre içinde organel kaybı. İntrasitoplazmik vakuolizasyon (H&E X100)

Şekil 2: CyA alan grupta kalp dokusu kesitleri. Hücre infiltrasyonu. Fibrozise gidiş. (H&E X40)

Şekil 3: CyA alan grupta kalp dokusu kesitleri. Myofibrillerde düzensizlik. Küçük hemorajik alanlar. (H&E X40)

Şekil 4: CyA +melatonin alan grupta kalp dokusu kesitleri. Nukleus yerleşimleri genelde merkezi(H&E X40)

Şekil 5: CyA+melatonin alan grupta kalp dokusu kesitleri. Normal kalp dokusuyla uyumlu. (H&E X100)

Kontrol, melatonin ve CyA+Melatonin alan grupları karşılaştırdığımızda; nukleus yerleşimi, sarkoplazmik vakuolizasyon, hücresel infiltrasyon, stromal fibrozis açısından istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulamadık. Bunun yanısıra hem kontrol ve CyA, hemde melatonin ve CyA grublarını karşılaştırdığımızda aynı parametrelerde anlamlı farklar bulduk. Yine CyA ve CyA+Mel grubunu istatistiksel olarak karşılaştırdığımızda nukleus yerleşimi, sarkoplazmik vakuolizasyon, hücresel infiltrasyon ve stromal fibrozis açısından p< 0. 05 idi. Koagülasyon nekrozunu istatistiksel olarak değerlendirdiğimizde ise tüm gruplar arasında anlamlı bir fark yoktu.

Strese karşı organizmanın ilk verdiği yanıt hücre şişmesidir ^19,20. Burada anormal sıvı birikimi sonucunda ışık mikroskobik düzeyde hücresel vakuolizasyonlar ortaya çıkar ²⁰, ve bu basit vakuoller tanı koydurucudur ¹⁹. Bizde çalışmamızda CyA verdiğimiz grubdaki histolojik değişimlerin, hücrenin strese verdiği cevap olduğunu, hücre şişmesine bağlı nukleusun yer değiştirip perifere itildiğini, sarkoplazmanın parçalanmaya başladığını, yine geri dönüşümlü hücre hasarı nedeniyle vakuollerin oluştuğunu düşündük. CyA grubunun yapısal değişikliklerini kontrol grubuyla karşılaştırdığımızda da saydığımız parametreler açısından aralarında istatistiksel olarak anlamlı fark olduğunu bulduk.

Dokularda hücre infiltrasyonunun serbest radikalleri ürettiği, bunun sonucunda da gelişen olayların lipid peroksidasyonu ve beraberinde hücreyi nekroza götüren olaylara yol açtığı araştırıcılar tarafından gösterilmiştir ²¹. Bianchi ve arkadaşları deneysel CyA tedavisinin, matrix metalloproteinaz enzim aktivitesinin artmasına ve miyokard ara maddesinde organizasyon bozukluğuna neden olduğunu saptamışlardır ⁶.

İnflamasyon, hasara uğramış hücre veya dokuların kendilerini korumak için verdikleri cevaptır ve sonuçta ödem, hücre infiltrasyonu, fibrozis ve doku nekrozuyla seyreder. Matrix metalloproteinaz aktivitesinin artması fibroblast göçünün, fibronektin ve kollagen sentezinin artmasına neden olmaktadır ¹⁹. Nekroz ise hücre ölümünün yaygın tipidir. Genelde iskemi ya da kimyasal hasar gibi stresler sonucu ortaya çıkar. Kalpte koagülasyon nekrozu eozinofilik, nukleussuz myokardial lifler ve lökosit infiltrasyonuyla gider ve bunlar nekrozisin kalp kasındaki erken bulgularıdır ¹⁹.

Çalışmamızda CyA verdiğimiz grubunun morfolojik değişikliklerini kontrol grubuyla karşılaştırdığımızda, hücre infiltrasyonu ve stromal fibrozis açısından istatistiksel olarak aralarında anlamlı fark olduğunu bulduk (p<0.05). Tüm bulgular inflamasyonla birlikte, nadir alanlarda koagülasyon nekrozunu akla getirirken, hemorajik ve nukleussuz alanların çok olmaması, bu doz ve süredeki CyA’nın henüz geri dönüşümlü hasar yaptığını düşündürdü.

Grieve ²² ve Rezzani benzer zamanlarda yaptıkları çalışmalarla CyA’ya bağlı zararlı etkilerin oluşmasında en olası yolun oksidatif stres olduğunu göstermişlerdir. Serbest oksijen ürünleriyle, endojen antioksidan sistem arasındaki dengesizlik sonucu oluşan oksidatif stresin doku hasarına neden olduğu birçok çalışmada da belirtilmektedir ⁶.Bu şartlar altında endojen antioksidanların serbest oksijen ürünlerine karşı koyamadıkları saptanmıştır ^8,22. Bu durumun CyA’nın kardiyak hücrelere etkisi içinde geçerli görülmektedir. Sonuçta CyA’ya bağlı kardiyotoksisite mekanizması hakkında yeterli veri olmasada 2 ihtimal üzerinde durulur. Bunlardan biri bu metabolizma sırasında serbest oksijen ürünlerini arttırması, diğeri de antioksidan sistemin hasarlanmasıdır ⁶.

Melatonin hem yağda, hemde suda çözünür özellikte olduğu için, nukleus dahil hücrenin her organeline ulaşabilir ^23,24. Bu özelliklerinden dolayı melatoninin konjestif kalp yetmezliğinde etkili olduğu da kabul edilmektedir ²⁵.

Melatoninin oksidatif stresin olduğu birçok durumda serbest oksijen ürünlerini zararsız hale getirdiği, ya da daha az toksik maddelere dönüştürdüğü ve morfolojik değişikliklere karşı da koruyucu etki gösterebileceği rapor edilmiştir ^26,27. Bu nedenle melatoninin, CyA’ya bağlı gelişen yan etkilere de pozitif etkisi olduğu düşünülmüştür ¹⁰. Son yıllardaki çalışmalarla pinealektomi yapılmış sıçanlarda, özellikle miyokard ve böbrekte ciddi yapısal değişikliklere rastlanmış ve bunlara ek olarak serbest oksijen ürünlerininde arttığı gözlemlenmiştir. Yine bu çalışmalarda deneklere melatonin verilmesi bu değişiklikleri engellemiştir ^28-30. Melatoninin kardiyovasküler sistemde hiçbir yan etkisi olmayan, son derece güvenli, koruyucu bir hormon olduğu düşünülmektedir ^31-33. Siwik ve arkadaşları yaptığı çalışmalarda antioksidan sistemin inhibe olmasının CyA’ya bağlı yapısal hasarın nedeni olduğunu göstermişlerdir. Böylece tüm bu çalışmalarla CyA gibi ilaçlara bağlı toksisitelere karşı antioksidanların koruyucu etkisinin olduğu düşüncesi desteklenmiştir ⁶. Rezzani ve arkadaşları da melatoninin CyA’nın yan etkilerine karşı oldukça güçlü bir kalp koruyucu olduğunu göstermişlerdir. Bu çalışmaya göre 21 gün boyunca CyA alan sıçanlarda kardiyolojik hücre yapısında değişiklikler ve antioksidan enzim aktivitesinde ciddi azalma saptanmıştır. Bu bilgiler de oksidatif stres ile CyA bağlı toksitesite arasındaki bağlantıyı bir kez daha kanıtlamaktadır. Bütün bunlar CyA’nın hem serbest oksijen ürünlerini arttırdığını, hemde protein hasarı yaptığını göstermiştir. Bu çalışmayla melatoninin bu ürünleri yakalayıcı etkisi sayesinde kardiak fibrozisi azaltabileceği yada tamamen ortadan kaldırabileceği ispatlanmıştır ¹⁰.

Çalışmamızda CyA ile birlikte melatonin verdiğimiz grubda nadir alanlarda hafif fibrozisin olduğunu izledik. Yine buralarda minimal düzeyde hücre infiltrasyonunun söz konusu olduğunu fark ettik. Sadece CyA verdiğimiz grubumuzda gördüğümüz küçük çaplı hemorajilere ise hiç rastlamadık. CyA ile birlikte melatonin verdiğimiz grubu morfolojik parametreler açısından istatistiksel olarak kontrol grubuyla karşılaştırdığımızda koagülasyon nekrozu dışındaki bulgularda aralarında anlamlı fark bulduk. Sonuç olarak; bu doz ve sürede kullanılan CyA’nın yaptığı kardiyolojik hasarın henüz geri dönüşümlü olduğunu ve verilen melatoninin etkisiyle hasarın azaltılabileceğini düşündük. Eğer CyA ve melatoninin birlikte kullanımıyla ilgili daha ileri çalışmalar yapılabilirse, ömür boyu çeşitli nedenlerde dolayı CyA kullanmak zorunda kalan hastalarda, CyA’nın kalp üzerine olan zararlı etkilerinin azaltılabileceği fikrindeyiz.