Yeni doğan ünitelerine yatırılan özellikle prematüre bebeklerin edinsel gastrointestinal hastalıklarından en önemlisi olan nekrotizan enterokolit (NEK), etyolojisi tam aydınlatılamamış ve mortalitesi yüksek bir hastalıktır¹. Hastalık bebeklerde yerleştikten sonra hızla ilerleyebilmekte ve tüm sistemleri etkileyerek organ yetmezliklerine sebep olabilmektedir ². Patogenezi tam olarak aydınlatılmamış olmasına rağmen hastalığın etiyolojisinde prematürite, hipoksi, formüla mama ile beslenme, bakterial infeksiyon, intestinal iskemi ve gastrointestinal distansiyon gibi risk faktörlerinin etkili olabileceği bilinmektedir ^3-8. Yapılan bazı çalışmalarda serbest oksijen radikalleri, tümör nekrozis faktör, platelet aktive edici faktör ve lökotrienler gibi bazı inflamatuar mediatörlerin hastalık patogenezinde rol oynadıkları da gösterilmiştir ^9-12.

Hipoksinin NEK oluşumuna olan etkisi azalmış mukozal kan akımı ve artmış oksijen ihtiyacı üzerinden olmaktadır ¹³. Aynı zamanda hipoksik stres platelet aktive edici faktör miktarını artırmakta ve serbest oksijen radikal hasarı yapmaktadır ^10,14. Gastrointestinal sistem motilitesi üzerine hipoksinin olumsuz etkilere neden olduğu da bilinmektedir. Hayvanlarda hipoksi oluşturularak yapılan bazı deneysel çalışmalar da hipoksinin intestinal intirinsik ritmi ve mide boşalmasını geciktirdiği, spontan incebarsak ve mide kontraksiyonlarını azalttığı gösterilmiştir ^15-18. Hipoksinin neden olduğu gastrointestinal sistem kontraksiyon azalması indirekt olarak da bakteri translokasyonu riskini artırmaktadır. Hipoksinin neden olduğu gasrointestinal sistem motilite azalması hayvan deneylerinin yanı sıra izole insan barsağında da gösterilmiştir ¹⁹.

Enerji metabolizması ve gıda alınan düzenlenmesinde etkili olan Leptin 16-k D ağırlığında bir proteindir ve özellikle adipozit hücreleri tarafından sentezlenmektedir. Rat ince barsağında çok sayıda leptin reseptörlerinin varlığını göstermiştir ²⁰. Yapılmış bazı çalışmalar leptinin ratlarda ince barsak boyunu uzattığını, mukozal kütleyi artırdığını ve ince barsaklarda emilim fonksiyonlarını geliştirdiğini göstermiştir ^21,22. Leptin bu özellikleri nedeniyle ince barsak için yeni bir büyüme faktörü olarak adlandırılmıştır. Ayrıca kedilerde yapılan bir deneysel çalışmada leptinin kolesistokinin varlığında barsak kontraksiyonlarını artırdığı da gösterilmiştir ²³. Leptin yine kısa barsak sendromunda kalan barsak segmentinde emilim fonksiyonlarını artırarak yeni bir kullanım alanı daha bulmuştur ²⁴. Bunlarla birlikte leptin büyüme hormon düzeylerini artırmakta ve ince barsaklarda büyüme hormonun mukoza üzerindeki bariyer koruyucu etkisine sebep olmaktadır ²⁵.

Bu sebeple yeni doğan ratlarda incebarsak hipoksireoksijenasyon hasarına karşı leptinin etkilerini araştırmak istedik.

Ağırlıkları 180-210 gr arasında değişen Sprague-Dawley cinsi 7 ayrı rat gebe bırakıldıktan sonra normal şartlar altında (21- 23º C) ayrı ayrı kafeslerde takibe alındı. Doğum zamanı yaklaştığında habersiz doğumlara engel olmak için takip sıklığı artırıldı. Bakıcı kontrolünde doğumların gerçekleşmesi sağlanarak yavruların doğar doğmaz anne sütü almalarına engel olundu. Doğum sonrası rastgele seçilmiş 30 adet yavru rat kendi aralarında üç eşit gruba bölünerek deneysel gruplar oluşturuldu. Grup 1 kontrol grubu olurken Grup 2 hipoksireoksijenasyon grubu, Grup 3 ise leptin hipoksi-reoksijenasyon grubu olarak belirlendi. Gruplarda yavru ağırlıkları ortalama olarak Grup 1 de: 5.-5.2 gr, Grup 2 de: 5.1 -5.2 gr ve Grup 3 de: 4.9-5.1gr idi. Anne sütü almadan ayrılmış olan Grup 2 ve Grup 3 yavruları doğumdan hemen sonra deneysel işleme tabi tutuldular. Grup 3 deki yavru ratlara deneysel islemden 1 saat önce ciltaltı enjeksiyonla 20 mikrogram/kg leptin verildi. Bu gruplardaki yavrular bacaklarına konulan işaretler ile bir cam kavanoz içerisine koyuldular. Kavanoz içerisindeki hava aspiratör yardımı ile boşaltıldıktan sonra kavanoz tekrar karbondioksit ile dolduruldu. Yavruların 10 dk bu oksijensiz yoğun karbondioksitli ortamda solumaları sağlandı. 10. dakikada karbondioksit aspire edildi ve kavanoz oksijen ile dolduruldu. Böylece yoğun oksijen ile reoksijenasyon yapılmış oldu. Onuncu dakikadan sonra yavrular tekrar dışarı alındı ve 10 dakika soğuğa maruz bırakıldı. Bu işlem bir kez daha baştan sona tekrarlandıktan sonra yavrular annelerine verildi ve anne sütü almaları sağlandı. Uygulanan bu işlemler serisi 2. ve 3. günlerde de tekrarlandı. Üçüncü günü yavrular dekapite edildi ve gastrointestinal sistemleri çıkarıldı. Tüm barsak sistemi makroskobik NEK bulguları açısından incelendikten sonra terminal ileumdan 3 cm uzunluğunda ince barsak dokuları alındı. Barsakta renk değişimi, barsakta kanama, ileal distansiyon, ve/veya ileal darlık makroskobik NEK değerlendirme kriterleri olarak alındı. Terminal ileumdan alınan doku örneklerinde histopatolojik olarak 1 den 5 e kadar derecelendirme ile ileum hasarı ve immunhistokimyasal boyama ile epidermel büyüme faktör reseptörleri (EBFR) bakıldı ve bir kısım doku biyokimyasal inceleme için ayrıldı. İleum yapısındaki değişiklikler gruplardan habersiz bir araştırmacı tarafından tipik NEK bulguları açısından derecelendirildi. Hemotoksilen&Eozin ile yapılan bu incelemede değerlendirme Grade 1; normal histoloji, Grade 2 ; hidropik dejenerasyon ve/veya yüzeyel epitelial hücrelerin lamina propriadan ayrılması, Grade 3 ; villus uçlarına sınırlı epitelyal hücre nekrozu, Grade 4 ; villus nekrozu, Grade 5; tam kat nekroz olacak şekilde yapıldı. Immün boyama ile yapılan incelemede genel boyanma paterni saptanabilir boyanma yok (-), hafif şiddette boyanma (+), orta şiddette boyanma(++), kuvvetli boyanma (+++), çok yoğun boyanma(++++) olacak şekilde sınıflandırıldı.

Biyokimyasal incelemede; dokularda malondialdehit (MDA) ve nitrik oksit (NO) yan ürünü olan nitrit ölçüldü (Griess yöntemi) (26). Biyokimyasal değerler için önce Kruskal-Wallis testi uygulandı, gruplar arasında fark olduğu görülünce gruplar Mann Whitney U testi ile karşılaştırıldı. Histopatolojik inceleme sonuçları x2 testi ile değerlendirildi. P< .05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

Grup 2 ve Grup 3 deki hayvanlarda makroskobik NEK bulgularına rastlandı. H&E boyama ile yapılan histopatolojik incelemede Grup 2 ve Grup 3 de Grade 2 ve Grade 3 hasarlar gözlendi (Tablo 1)(Resim 1).

Tablo 1: Dokularda histopatolojik hasar derecelemesi

Resim 1: Hafif hasar, yüzey epitel hücrelerinde hidropik dejenerasyon (hematoxilen-eozin x200) (Grade 2 barsak hasarı)

Grup 2 ve Grup 3 de histopatolojik olarak hasar farksızdı (p >.05). Immunhistokimyasal incelemede Grup 2 ve Grup 3 de kontrol grubuna göre daha az immün boyanma göründü (p<.05) (Tablo 2) (Resim 2, Resim 3). Grup 2 ve Grup 3 de immunhistokimyasal olarak EBFR boyanması da farksızdı (p >.05). Grup 2 ve Grup 3 de barsak dokusu MDA seviyeleri kontrol grubuna göre artmış (p<.0001) ve birbirinden farksızdı. (p >.05) (Tablo 3). İnce barsakların nitrit düzeyleri Grup 2 de diğer gruplardan yüksek bulundu (p<.001). Grup 3 de nitrit düzeyleri kontrol grubundan farksızdı (p >.05) (Tablo 4).

Tablo 2: Dokularda EGFR immunhistokimyasal boyanması

Resim 2: EBFR için hafif immünohistokimyasal boyama. (immunperoxidase boyası, x400). (+ EBFR boyanması)

Resim 3: EBFR için şiddetli immünohistokimyasal boyama. (immunperoxidase boyası, x400). (+++ EBFR boyanması)

Tablo 3: Gruplarda doku MDA (nmol/mg prot) analiz sonuçları

Tablo 4: Gruplarda doku Nitrit (µmol/mg prot) analiz sonuçları

Serbest oksijen radikallerinin sebep olduğu lipid peroksidasyon hasarında MDA ölçümü geleneksel olarak kullanılmaktadır. NEK patogenezinde serbest oksijen radikallerinin etkileri, asfiksi-NEK ilişkisi ve deneysel intestinal iskemi ve NEK ilişkileri ile ileri sürülmüştür ^27,28. Hipoksinin neden olduğu NEK etiyolojisini açıklayabilmek amacıyla ciddi anoksik epizotlar geçiren yeni doğanlarda ‘diving reflex’ diye tabir edilen bir mekanizma tarif edilmiştir ²⁹. Bu görüşe göre hipoksik veya ciddi anoksik durumlarda kan beyin ve kalp gibi hayati organlara gitmekte ve bu olaylar esnasında barsaklar da hipoksiye maruz kalmaktadırlar. Bu çalışmamızda Grup 2 ve Grup 3 de MDA değerlerimiz arasında bir fark bulunmadı. Histopatolojik incelemede yine bu iki grup arasında doku hasarının farklı olmaması leptin tedavisinin yenidoğan ratlarda hipoksi-reoksijenasyonun neden olduğu incebarsak hasarına olumlu etki etmediğini göstermiştir.

Nadler ve arkadaşları formüla besleme ve hipoksi uygulaması ile rat yavrularında deneysel olarak NEK oluşturmuşlar ve hasarlı incebarsaklarda nitrik oksit sentaz-mRNA (iNOS mRNA) artışı tespit etmişlerdir ³⁰. Bu bulgu deneysel NEK modellerinde barsak hasarı oluşumuna nitrik oksitin de etki ettiğini göstermektedir. Zhang ve arkadaşları yenidoğan rat yavrularınına sadece hipoksi uygulayarak incebarsak hasarı oluşturmuşlar ve hasarlı ince barsak dokusunda iNOS artışı olduğunu göstermişlerdir ³¹. Bizim çalışmamızda da NEK sadece hipoksi ve soğuk uygulaması ile oluşturuldu ve iNOS artışını değerlendirmek için dokularda nitrik oksit (NO) yan ürünü olan nitrit bakıldı. Grup 3 de dokuların nitrit düzeyleri Grup 2 den daha düşüktü ve kontrol grubu ile aynıydı. Leptinin sistemik NO miktarını ve gastrik ülser iyileşmesinde ülser kenarında iNOS aktivitesini artırdığı bilinmektedir ancak ince barsakta NO sentezini azalttığı henüz bildirilmemiştir. Bizim çalışmamızda nitrit seviyeleri Grup 3 de Grup 2 den daha az olmasına rağmen doku hasarı her iki grupta farksızdı. Grup 3 deki bu NOS aktivite azalması muhtemelen nonspesifiktir (cNOS ve iNOS azalması) çünkü faydalı etkilere sahip cNOS azalmamış olsaydı hipoksireoksijenasyon sonrası iNOS aktivite azalması doku hasarını azaltabilirdi.

Leptin barsak boyunu büyütüp, barsak mukozal yüzey kütlesini artıran bir hormon olarak tariflenmiştir. Bu etkilere barsakda neden olurken hangi mekanizma üzerinden etkili olduğu henüz tam olarak bilinmemektedir. Epidermal büyüme faktörün barsakda önemli bir büyüme faktörü olduğu bilindiği için biz burada leptinin muhtemel etkisini EBFR ile araştırmak istedik. Bu nedenle bu çalışmada dokularda EBFR reseptör dağılımına immunhistokimyasal boyama ile baktık. Deneysel işlem uygulanan Grup 2 ve Grup 3 de kontrol grubuna kıyasla daha az immün boyanma görülmesine rağmen bu iki grup arasında immün boyanma farkı gözlemlemedik. Bu sonuç da MDA ve H&E boyama ile yaptığımız ileum hasar derecelemesi sonuçlarımızla uyumlu olarak leptinin yeni doğan rat incebarsak hipoksi reoksijenasyon hasarına ve hasar sonrası iyileşme sürecine olumlu etki etmediği sonucumuzu destekler özelliktedir.

Bu çalışmada uyguladığımız NEK modeli Okur ve arkadaşlarının uyguladıkları NEK modelinin bir modifikasyonudur ³². Aynı modeli NEK etyolojisinde distansiyonun rolünü çalışan Kazez ve arkadaşları da kullanmışlardır ⁸. Biz burada barsaklarda daha ileri dereceli hasar oluşturmak için hipoksi süre ve sayısını artırdık ve soğuk stres uygulamasını ilave ettik. Literatürde bildirilen ve formüla mama uygulaması ile yapılan bir NEK modelini sadece hipoksinin neden olduğu incebarsak hasarı üzerinde çalışmak istediğimizden tercih etmedik. Aynı zaman da bu yöntemin uygulanabilirliğinin kolay olması da tercih nedenlerimizden bir tanesi olmuştur. Deneysel metodu üç gün tekrar etmemizdeki neden ise ön çalışmalarımız esnasında barsaklarda yeterli hasar oluşturabilmek için işlemin en az üç gün tekrar edilmesi gerektiğini belirlememizdir. Bu yöntemin üç günlük tekrar ile uygulanması aynı zanmanda hipoksik stresler arasında bir barsak rejenerasyon sürecine fırsat tanımıştır ki bu rejenerasyon süreci ile leptinin barsak mukozasına olabilecek muhtemel olumlu etkileri için süre tanınmıştır.

Sonuç: Leptin hipoksi-reoksijenasyonun neden olduğu yenidoğan rat ince barsak hasarını azaltmamış ve tekrarlayan hasarlanma periyodları arasında barsakda mukozal rejenerasyonu hızlandırmamıştır.