Bleomisin (BLM), streptomyces verticullus türünden elde edilmiş antitümöral etkili bir antibiyotiktir ¹. Akciğer, böbrek, periton ve lenf sisteminde yüksek oranda konsantre olduğu gösterildiği için deri kanserleri, baş boyun kanserleri, uterus kanseri, serviks kanseri, hodgkin hastalığı, retikülosarkkom, lenfosarkom, embriyonel hücreli koriokarsinom ve teratokarsinomun tedavisinde kullanılır. BLM, bleomisin-demir kompleksi oluşturarak moleküler oksijeni, süperoksit ve hidroksil radikallerine dönüştürür. Bu da DNA� da iplikcik kırılmalarına ve DNA-RNA-protein sentezinde (trankripsiyon ve translasyon basamakları) hasara sebep olarak anti-neoplastik etki gösterir ². Bleomisini inaktive eden hidrolaz enziminin akciğer dokusunda diğer dokulara oranla çok düşük düzeyde bulunmasından dolayı yan etki olarak özellikle akciğerlerde yaygın fibrozis ve interstisyel pnömoni oluşturur ve BLM kullanılan hastalarda akciğer hasarı gelişme oranı %3-40 oranında değişmektedir ³. Bu durumda gelişen akciğer fibrozisinde serbest oksijen radikallerinin önemli faktörlerden biri olduğu iddia edilmektedir ⁴. Bu aktive olmuş oksijen türleri DNA kırıklarının yanı sıra ilave olarak lipit peroksidasyonuna da sebep olduğu gösterilmiştir ⁵. Kafeik asit fenetil ester (CAPE), yapıca flavanoidlere benzeyen ve iki halkasal yapı içeren kimyasal bir bileşen olup halkalardan bir tanesi molekülün hemen hemen bütün kimyasal özelliklerini gösteren fonksiyonel gruplar olan iki adet �OH grubu taşır. Bu hidroksil grupları diğer bazı antioksidan vitaminler de ve vitamin olmayan antioksidan maddelerde olduğu gibi aktif şekilde elektron alıp vererek oksidasyon-redüksiyon (redoks) özellikleri gösterir. Yapısı uzun aromatik ve alifatik özellikli karbon grupları taşıdığı için aynı zamanda lipofilik özellikte gösterir. Bu özelliği, molekülün rahatça vucuttaki membran yapılarını geçmesini ve etki edeceği bölgeye kolay ulaşmasını sağlamaktadır. CAPE, antienflamatuvar, sitostatik, antikanserojen, antiproliferatif, antioksidan özellikleri gösterilmiş olup ^6-13 fibrozisteki etkisinin çalışıldığı çok az çalışmaya rastlanmıştır. Bu çalışmalarda CAPE�nin antioksidan etkileri gösterilmiş ¹⁴ ancak bleomisinin DNA üzerine etkisi ve CAPE�nin pürin katabolizması üzerine koruyucu etkisi gösterilmemiştir. Bu deneysel çalışmada, sıçanlara intratrakeal BLM uygulayarak akciğer fibrozisi oluşturup DNA hasarına olan etkisini pürin katabolizması enzim aktivitelerini tespit ederek göstermeyi planladık. Ayrıca antioksidan bir madde olan CAPE ve E vitamininin bu hasar üzerindeki düzeltici etkisini göstermeyi ve bu iki antioksidan ajanı birbirleri ile karşılaştırmayı amaçladık.

Bu çalışmada, Sprague Dawley tipi erkek sıçanlar kullanıldı. Deney gününe kadar havalandırması olan ve gün ışığı alan (12 saat gece 12 saat gündüz) odalarda özel kafeslerde tutulan sıçanlara ad libitum standart pellet yem ve çeşme suyu verildi. BLM uygulamasından bir gün önce, yemleri kesilen sıçanların ağırlıkları tartıldı ve ağırlıkları 250 gr�ı geçen sıçanlar rasgele alınarak, kontrol grubunda 8, deney gruplarında 10�ar sıçan olacak şekilde gruplandırıldı. Sıçanlar tartıldıktan sonra ağırlıklarına göre xylazine (1 mg/kg) ile ketamin (0.5 ml/kg) karışımı intraperitoneal (ip) uygulama ile genel anestezi yapıldı.

Grup-1: Kontrol grubu (n=8); BLM uygulanmasından iki gün önce %10�luk etil alkol ip olarak 1x1 (günde bir kez) uygulandı. CAPE�nin etil alkolde çözünmüş olmasından dolayı etil alkol verilmiştir. 0. (sıfırıncı) gün ise intratrakeal (it) olarak BPS (Buffer Phosphat Saline) (bleomisinin, BPS�de çözündüğünden dolayı) verilmiştir.

Grup-2: BLM grubu (n=9): 0. gün it olarak BLM enjekte edildi. 7.5 ü/kg BLM (Bleocin; bleomycin hydrochlorid; Nippon Kayaku CO., Ltd., Tokyo, Japonya) 250 Vl BPS içinde çözülerek verildi.

Grup-3: BLM+E vitamini grubu (n=9): BLM uygulamasından iki gün önce E vit (Epynal-ROCHE) 10 mg/kg dozda 1x1 olarak verildi, 0. gün it olarak BLM verildi (7.5 U/kg, 250Vl BPS içinde)

Grup-4: BLM+CAPE grubu (n=10): BLM uygulanmasından iki gün önce 10µmol/ml� lik CAPE� den 10 µmol/kg verildi. BLM ise it olarak 0. gün 7.5 U/ kg verildi.

BLM uygulanmasından 14 gün sonra genel anestezi altında göğüs boşlukları orta hat boyunca açılarak akciğer dokuları doku bütünlüğü korunarak çıkartıldı. Dokular hemen sıvı azot tankı ile donduruldu ve deney gününe kadar �85 ºC de derin dondurucuda (Nuaire �85 ºC Ultralow Freezer, Japonya) saklandı. Biyokimyasal parametreleri çalışmak üzere derin dondurucudan çıkartılan akciğer dokuları, yaş doku ağırlıkları tartıldı ve küçük parçalara bölünerek cam tüplere konuldu. Üzerine Tris-HCl tamponu eklenerek homojenizatör (Ultra Turrax Type T25-B, IKA Labortechnic, Germany) ile 16000 devir/dk hızda üç dakika süre ile dokular homojenize edildi. Elde edilen homojenat 5000xg� de bir saat santrifüjde çevrilerek dokuların süpernatantları elde edildi. Tüm analiz işlemleri boyunca numune örnekleri +4 ºC muhafaza edildi. Akciğer dokularında ksantin oksidaz (XO) ¹⁵, adenozin deaminaz (ADA) ¹⁶ ve glutatyon peroksidaz (GSH-Px) ¹⁷ enzimleri çalışıldı.

İstatistikler Windows 95-98 uyumlu SPSS® programı yardımı ile yapıldı. Grupların dağılımına Non-parametrik testlerden one-sample Kolmogorov-Smirnov Test ile bakıldı. Dört Grupta da yer alan tüm sonuçlar normal dağılım gösterdiğinden Parametrik testlerden one-way ANOVA testi uygulandı, Post Hoc testlerden LSD (Least significant difference) ile gruplar arası anlamlılık incelendi. İstatistiksel anlamlılık için p<0.05 olan değerler anlamlı olarak kabul edildi. Değerler ortalama ± ortalamanın standart hatası (SEM) olarak verildi.

Sonuçlar Tablo-1�de kısaca özetlenmiştir. Antioksidan bir enzim olan GSH-Px enzim aktivitesi BLM verilen grupta kontrol grubuna göre anlamlı ölçüde düşük bulunmuştur (p=0.0001). CAPE daha etkin olmak üzere E-vit ve CAPE, GSH-Px aktivitesinde anlamlı bir artmaya sebep oldu (p=0.0001). BLM grubunda XO ve ADA enzimleri anlamlı şekilde yüksekti (sırası ile p=0.003 ve p=0.0001). CAPE ve Evit ise BLM grubundaki bu yükselmeyi önemli ölçüde düşürerek kontrol grubu seviyesine düşürmüştür.

Tablo 1: Deney gruplarında akciğer dokusu XO, ADA ve GSH-Px enzim aktiviteleri. Sonuçlar ortalama ± ortalamanın standart hatası (SEM) olarak verilmiştir.

Bleomisinin direkt olarak trakea içine uygunlandığı bu deneysel çalışmada, deney süresinin sonunda, akciğer fibrozisinin beklenen klinik belirtilerinin hemen hepsi gözlendi. Sadece BLM verilen grupta (grup II), sıçanların göğüs boşluğu açıldığında çıplak gözle bile görülebilen diffüz tipte fibrotik değişiklikler izlendi. Yine bu gruptaki sıçanlar 7. günden itibaren 14. güne doğru daha da artmış olarak zayıflamaya ve hırıltılı solumaya başladılar. Zamanla solunum sırasında sıçanların burun kanatları solunuma katılmaya başladı ve interkostal çekilmeleri mevcuttu. İştahları zamanla azaldı. Deneyin başladığı günlere göre günlük yem ve su tüketimi azalmaya başladı. Son günlere doğru özellikle BLM grubunda daha fazla olmak üzere bazılarının burunlarında muhtemelen hemoptiziye bağlı kanamalar görüldü. Bu klinik bulgular E-vit grubunda daha hafif seyirli idi. CAPE grubunda ise kontrol grubu ile hemen hemen aynı klinik tablo mevcuttu.

Rahman ve ark. akciğerin antioksidan savunmasında Glutatyonun (GSH) kritik bir öneme sahip olduğunu ve özellikle hava yolları epitelinin oksidan hasardan ve inflamasyondan korunmasında esansiyel olduğunu savunmuşlardır ¹⁸. GSH�ın redoks durumundaki dengesizlikler, inflamatuar akciğer hastalıklarında proinflamatuar genlerin transkripsiyonuna yol açmaktadır ¹⁹. Dolayısıyla CAPE�nin GSH-Px enzim aktivitesini indirekt yoldan artırmak için verilmesi mantıklı bir girişim olabilir. Çünkü bu bileşik GSH�ın sentezine ve redüklenmesine katkıda bulunarak GSH-Px enzim aktivitesini artırabileceği düşüncesindeyiz.

Bleomisinle olusturulan fibrozis üzerine oral erdosteinin etkilerinin araştırıldığı bir çalışmada BLM verilen sıçanların akciğer dokularında antioksidan enzimlerden superoksid dismutaz (SOD) ve glutatyon peroksidaz enzim aktivitelerini yüksek olduğu bulunmuştur. Akciğer fibrozisi üzerine CAPE�nin etkilerinin araştırıldığı bir başka araştırmada bleomisin verilen grupta SOD ve katalaz (CAT) enzim aktivitelerinde kontrol gruplarına göre azalma tespit edilmiştir. Yine her iki çalışmada da BLM verilen sıçanların akciğer dokularında serbest oksijen radikallerine bağlı lipit peroksidasyon ürünü olan malondialdehit (MDA) ve dokudaki fibrozisin direkt göstergesi olan hidroksiprolin seviyeleri artmış olarak bulunmuştur ^14,20.

Bizim bu çalışmamızda da BLM uygulanan grupta GSHPx enzim aktivitesini daha önceki çalışmalarla uyumlu olarak düşmüş olarak bulduk (p=0.0001). Bu azalmanın sebebi, BLM� nin direkt olarak enzimlerin protein yapılarının üzerine etkisi sonucu veya indirekt bazı mekanizmaları harekete geçirmesi ile meydana gelmiş olabilir. Örneğin BLM akciğer dokusunda aşırı düzeyde birikerek ROS üretimini arttırdığında, bu antioksidan enzimler bu oksidatif stresi giderebilmek için aşırı bir aktivite gösterip sonunda yıkılmış olabilirler. Anlaşılıyor ki, antioksidan özellikteki CAPE ve E-vit serbest radikal süpürücü özelliklerinden dolayı GSH-Px aktivitesinin artmasına sebep olmuş (p=0.0001) ve kontrol grubu seviyesine yaklaştırmış olabilir.

Ksantin oksidaz, oksidaz (XO) ve dehidrogenaz (XDH) isoformları şeklinde bulunur ²¹. Çoğu dokularda NAD+- bağımlı dehidrogenaz enzimi baskındır fakat tiol grupları oksidasyona veya proteolize uğradığı zaman oksidaz formuna çevrilir ²². XDH-XO dönüşümü ve hipoksantin oluşumu reperfüzyon hasarını takiben organların yeniden oksijenlenmesi sonucu oksidatif hasarda meydana gelir ²³. XO enzim seviyesinin yükselmesi Akut Respiratuar Distres Sendromlu ²⁴ hastaların plazmasında ve çoğu organların iskemi reperfüzyon hasarlarında gösterilmiştir ^25-27. Daha önceki yapılan çalışmalara bakıldığında XO ve ADA enzim aktivitelerindeki artışın muhtemel sebebi akciğerlerdeki hasarın bir sonucu olabilir ^28,29.

BLM serbest radikal üreterek DNA hasarı oluşturduğundan ^4,5 pürin bazları katabolizmasının bir göstergesi olan XO ve ADA enzim aktivitelerinde BLM verilen grupta anlamlı derecede artışa sebep olmuştur (sırasıyla; p=0.003; p=0.0001). CAPE antioksidan etkisi ile DNA� yı oksidatif hasardan koruyarak pürin bazlarının yıkımını azaltıp XO ve ADA enzim aktivitelerini kontrol grubu seviyesine yaklaştırmıştır.

Antioksidan madde olan CAPE ve E vitamini pürin katabolizmasını azaltarak olumlu yönde etki göstermiş ve hatta CAPE ve E vitamini birbiri ile karşılaştırıldığında CAPE�nin daha etkili sonuçlara neden olduğu görülmüştür.

Pulmoner fibroziste, E vit ve CAPE�nin ayrı ayrı kullanılması, çalışmamızın verilerinde görülen faydalı etkileri nedeni ile önerilebilir. Herhangi bir sebebe bağlı olarak gelişip başlangıç aşamasında yakalanan fibrozis vakalarında veya antikanserojen ajan olarak BLM kullanılacak hastalarda uygulama öncesinde profilaktik amaçlı CAPE verilmesinin, bu ilacın yan etkisi olarak gözlenen fibrozis oluşumunu kısmen önleyebildiğinden, yararlı olabileceği kanaatindeyiz.

Sonuç olarak diyebiliriz ki, klinikte yaygın bir şekilde kullanılan BLM�nin, bu yan etkisini profilaktik olarak antioksidan kullanımı ile kısmen önlenebilir.