İn vitro fertilizasyon (IVF); laboratuvar koşullarında fertilize edilen oositten meydana gelen embriyonun, uterus içerisine yerleştirildiği bir tekniktir. IVF’da kullanılan in vitro kültür sistemleri, in vivo şartlara mümkün olduğunca benzer ortam koşulları sağlamayı amaçlayan sistemlerdir^1-3. Endometrial ko-kültür sistemini uygulayan Barmat ve ark.⁴ tarafından, bu sistemin embriyo gelişim parametrelerini iyileştirdiği ve oosit donasyonu vakalarında gebelik oranında artış sağladığı kaydedilmiştir. Simon ve ark.¹, insan embriyolarının blastosist aşamasına kadar kültüre edilebilmesini sağlayan ve kültür ortamına embriyonik parakrin moleküllerin salınımını indükleyen endometrial epitel hücrelerinden oluşan bir ko-kültür sistemi tanımlamışlardır. Monolayer ko-kültürlerin özelliklerinden biri medyumda ortaya çıkan embriyotrofik faktörlerdir. Aynı zamanda kültür ortamındaki zararlı elementlerin elimine edilmesi de bu hücre tiplerinin genel özellikleri arasındadır. Ko-kültür hücrelerinin asıl işlevi, embriyoların in vitro koşullarda blastosist aşamasına kadar kültüre edilebilmesini sağlamak ve yüksek implantasyon başarısını elde edebilmektir. Bu işlevini, insan embriyosunun in vitro koşullardaki metabolizmasını düzenleyerek gerçekleştirebilmektedir⁵. İnaktif kümülüs hücreleriyle yapılan monolayer ko-kültür uygulamasında blastosist gelişiminin önemli ölçüde arttığı gözlenmiştir⁶. Serum destekli medyumlar ile ko-kültürün kıyaslandığı prospektif randomize çalışmalarda da somatik hücrelerle ko-kültüre edilen embriyoların blastosiste ulaşma oranlarında artış görülmüştür⁷. Buna karşın, ko-kültür sistemleri ve geleneksel medyumlar arasında fark olmadığını belirten çalışmalar da vardır⁸. Birçok avantajına rağmen, IVF vakalarında endometrial reseptivite gelişiminin daha iyi anlaşılması açısından endometrial ko-kültürle ilgili bilinenler yetersizdir. Diğer hücre tiplerinin varlığında da, ko-kültürle embriyoların implantasyon yeteneğinin artırılması, ko-kültür sistemlerinin ileri gelişimiyle bağlantılıdır. Özellikle implantasyonun fonksiyonel çalışmaları için kokültürde uygun hücre dizilerinin kullanımı önemlidir⁹. Bu amaçla, insan üreme dokularından örneğin; ovidükt, endometrium, kümülüs-granülosa, nonhuman hücreler hatta ovaryan karsinoma hücreleri gibi çok sayıda hücre tipi kullanılabilmektedir. Ko-kültürün faydalı etkileri için; besleyiciler, substratlar, büyüme faktörleri ve sitokinler gibi embriyotrofik faktörlerin salınımı sözkonusudur¹. Erken embriyonik gelişme döneminde, sitokinler ve büyüme faktörleriyle ilgili olarak, embriyo ve anne arasında güçlü bir geçiş olduğu kanıtlanmıştır¹⁰.

Çalışmamız için iki grup oluşturuldu. TİB grubu için, İstanbul Memorial Hastanesi Yardımcı Üreme Teknikleri ve Genetik Tanı Merkezi’ne infertilite nedeniyle başvuran ve TİB endikasyonu konan toplam 17 birey ve çeşitli nedenlerle polikliniğe başvuran fertil 10 bireyin endometriyumlarından alınan biyopsi örnekleri toplandı. Örnekleme yapılmadan önce bireyler bilgilendirildi ve onamları alındı. İstanbul Memorial Hastanesi Etik Kurul onayı alınarak çalışmaya başlandı. IVF laboratuvarında endometrial gland epiteli ve stromal hücre isolasyonu ve ko-kültür için Barmat ve ark.’nın^4,11 kullandığı yöntemin laboratuvar koşullarına adapte edilmiş protokolü uygulandı.

Steril koşullarda, pipelle (Endocell, France) alınan endometrial biyopsi örnekleri, Early’s Balanced Salt Solution (EBSS) veya %0.9 izotonik sodyum klorür içinde IVF laboratuvarına getirilerek işleme başlandı. Tüm işlemler laminal flow altında steril koşullarda gerçekleştirildi. Endometrial dokular birkaç kez EBSS ile kan ve mukusun uzaklaştırılması için yıkandı. Yıkama sonrası doku parçaları mekanik olarak makas ile yaklaşık 1-2mm3 lük küçük parçalara bölündü ve 15ml’lik santrifuj tüplerine (Falcon 2095) transfer edildi. Enzimatik ayrıştırma için, doku parçalarının üzerine 0,25mg/ml kollajenaz Tip II ilave edildi, otomatik pastör pipeti ile birkaç kez homojenize edilip 5 dk. oda ısısında bekletildi (gravite sedimantasyon) ve bu süre sonunda çöken doku parçalarının üzerindeki süpernatant çekilerek başka bir tüpe transfer edildi. Diğer tüpe transfer edilen supernatant 400g’de santrifüj edilerek, santrifuj sonrasında süpernatant atıldı ve dipteki hücre pelletinin üzerine L-Glutaminli RPMI 1640, 1% PSA (penisilin, streptomisin, amfoterisin) ve 10,1% denature maternal serum ilave edildi. İlk tüpte dibe çöken ve enzimatik yolla tamamiyle parçalanmamış olan doku parçalarının üzerine tekrar kollojenaz Tip II 0,25mg/ml konuldu ve 37°C’deki çalkalamalı su banyosunda 5 dk bekletildi. Aynı işlem birkaç kez daha tekrarlandı. Her seferinde supernatant tüpten alınarak 1500g’de 5 dk santrifüjlendi ve stromal hücrelerin isolasyonu sağlandı. Enzimatik yolla tamamen ayrıştırılamayan ve özellikle gland epitel hücresi içeren dokular ise kollajenaz Tip II ile muamele edildi. Bu işlemler sonunda stromal hücreler ve tüpün dibinde kalan ve kar tanelerine benzeyen gland hücre grupları için tüplerin üzeri etiketlendi. Gland hücre grubu olarak kalan hücre peleti, 25cm²’lik hücre kültür flaskına ekildi. Stromal hücreler için etiketlenen tüplerin içerikleri tek bir tüpte toplanarak 1500g’de 5dk santrifüjlendi ve doku kültür flasklarına aktarıldı. Ko-Kültür medyumlarının 3 günde bir, günlük olarak hazırlanmış olan yeni ko-kültür medyumu ile değiştirilmesi sağlandı.

İstatiksel Analiz
İstatistiksel analiz için SPSS 11.5 paket programı kullanıldı. Fertil ve TİB grubundaki gland epitel ve stromal hücreler arasında karşılaştırma yapılabilmesi için Independent-Samples T testi uygulandı.

Fertil ve TİB grubu bireylerin endometrial gland epiteli ve stromal hücre içeren ko-kültürlerinin invert mikroskopla görüntüleri incelendi. Şekil 1a ve 1b; fertil, Şekil 2a ve 2b’deki fotoğraflar ise TİB grubunun 7-10 gün kültüre edilen endometrial dokularından elde edildi. Fotograflar invert mikroskopla X40’lık büyütmelerde çekildi. Her iki grupta da endometrial gland epitel hücreleri ve stromal hücreler belirgin olarak izlendi. Fertil gruba ait Şekil 1a ve 1b’de, kültür kabını %90 oranında kaplayan ko-kültür hücreleri gözlendi. Kabın büyük kısmında gland ve stromal hücrelerin iyi konflue oldukları tesbit edildi. Gland epitel hücreleri yuvarlak ve uzantısız daha belirgin sınırlı oluşlarıyla, stromal hücrelerse çok uzantılı, iğsi biçimleri ile karakteristik görünümde izlendi. Şekil 2a ve 2b’de ise TİB grubu ko-kültür hücrelerinin fertil gruptakine benzer şekilde yer yer iyi konflue oldukları, yer yer daha az gelişim gösterdikleri tesbit edildi. Ayrıca fertil ve TİB grubunun gland ve stromal hücrelerinin karşılaştırılması yapıldığında, hem sayısal hem de kültür ortamındaki gelişimleri açısındandan farklılıklar olduğu gözlendi.

Şekil 1a, 1b: Fertil grup endometriyal doku ko-kültürlerinde gland ve stromal hücreler. Beyaz ok; gland hücresi. Siyah ok; stromal hücre.

Şekil 2a, 2b: TİB grubu endometriyal doku ko-kültürlerinde gland ve stromal hücreler. Beyaz ok; gland hücresi. Siyah ok; stromal hücre.

Fertil ve TİB grubu gland epitel hücreleri değerlendirildiğinde istatistiksel açıdan farklı olduğu bulunmuştur (p=0.001). Fertil ve TİB grubu stromal hücreleri karşılaştırıldığında ise, yine istatistiksel açıdan anlamlı bir fark olduğu gözlenmiştir (p=0.001), (Tablo 1).

Tablo 1: Fertil ve TİB grubundaki kadınların endometrium doku ko-kültürlerinin gland ve stroma hücreleri açısından karşılaştırılması

Ko-kültür yöntemi her ne kadar uygulaması nisbeten zor, titizlik ve tecrübe gerektiren zorlayıcı unsurlar bulundursa da, birçok araştırmada TİB olan vakalar için başarıyı artırdığı bilinmektedir. Embriyonun; eskiden beri kullanılmakta olan geleneksel medyumlardan oluşan besiyerleri yerine, anne endometriyumundan elde edilen otolog endometrial dokuda kültüre edilmesinin, gebelik oranını olumlu olarak etkilediği bildirilmiş^3,12,13 ve otolog endometrial ko-kültür birçok araştırmacı tarafından tercih edilmiştir. Ko-kültür uygulanan merkezlerde, her hastanın kendi özelliği göz önüne alınarak özel bir değerlendirme ile ko-kültür uygulaması yapılarak, konuyla ilgili belli standartların oluşturulması sağlanmıştır. Ko-kültür uygulama endikasyonlarını sıralayacak olursak; 35 yaş ve üstü hastalar, önceki Yardımcı Üreme Teknikleri (YÜT) denemeleri sonucu gebelik elde edilemeyen durumlar, yüksek FSH düzeyine sahip kadınlar, ovulasyon indüksiyon programlarına kötü yanıt veren hastalar, önceki denemelerinde düşük kalitede embriyo gelişimi (yüksek oranda fragmantasyon, yavaş embriyo gelişimi, düzensiz klivaj) gözlenen hastalar ve 3 veya daha fazla implantasyon başarısızlığı yaşayan hastalar şeklinde sayılabilir⁷. Bizim çalışmamızda da bu endikasyonlardan bir veya birkaçı nedeniyle önceki YÜT denemelerinde gebelik elde edilemeyen, üç veya daha çok sayıda implantasyon başarısızlığı olan hastalar kokültür uygulamasına dahil edilmiştir.

Joo ve ark’ nın¹⁴ çalışmasında endometrial kokültür sisteminin embriyo gelişimini desteklemesinde, embriyo ve helper (destek) hücreleri arasındaki hücreden hücreye direkt temasın varlığının etkili olduğu ifade edilmiştir. Ayrıca medyumlardan geriye kalan toksik zararlı maddelerin ve reaktif oksijen türlerinin ko-kültür hücreleri tarafından elimine edildiği ve aynı hücrelerin besleyici maddeleri kültür ortamına salarak embriyo gelişimini olumlu etkilediği gösterilmiştir. Birçok araştırmacının ko-kültür uygulamalarıyla ilgili olarak olumlu sonuçlar elde ettikleri ortaya konulmuştur. Bununla birlikte, ko-kültürün etkinliğiyle ilgili karşıt görüşlerde vardır. Fabbri ve arkadaşları ko-kültüre alınan embriyoların uterusa transferinden sonra gebelik oranlarının gerçek artışıyla, sonuçların çelişebileceğini belirtmişlerdir¹⁵. Plachot ve ark.¹⁶ kokültür sonucunda, granülosa hücrelerinin embriyo gelişimini olumlu etkilemesine rağmen, TİB olan bireylerde gebelik oranlarında bir gelişme sağlamadığını vurgulamışlardır. 2008’de yapılan bir meta-analizin detaylarında, ko-kültür çalışmaları arasında tutarsızlıklar ortaya çıktığı tesbit edilmiştir. Ancak insan veya insandan farklı çeşitli hücre dizilerinin kullanılmış olması, hücre tipi spesifikliği gibi durumlardan dolayı randomize kontrollü çalışmalara ihtiyaç olduğu belirtilmiştir^17,18.

Bu çalışmada, fertil ve TİB olan kadınların endometrial ko-kültürleri incelendiğinde, fertil grup kokültürlerinde, gland epitel hücreleri ve stromal hücrelerin hem morfolojik hemde sayısal açıdan oldukça iyi gelişim gösterdikleri sonucuna varılmıştır. (Şekil 1a,1b). Bu durum fertil bireylerde endometriyumun implantasyon için gerekli morfoloji ve moleküler alt yapıya sahip olduğunu düşündürmektedir. TİB grubunda ise gland epitel hücreleri ve stromal hücrelerin gelişim ve sayısal olarak farklılık gösterdikleri ortaya çıkmıştır (Şekil 2a, 2b). Ancak endometrial ko-kültür uygulamalarının bu grup için nde oldukça faydalı sonuçlar doğurduğu bilinmektedir. Rubio ve arkadaşları¹⁹ implantasyon başarısızlığı olan kadınlarda endometrial ko-kültür uygulamaları ile daha yüksek implantasyon ve gebelik oranları elde ettiklerini belirtmişlerdir. Kumtepe ve ark. endometrial ko-kültür uygulandıktan sonra transfer edilen embriyoların gelişmiş iç hücre kitlesi yapısına sahip olduklarını, gebelik sonuçları ve devam eden gebelik oranlarında anlamlı bir artış gözlendiğini bildirmişlerdir²⁰. Bizim çalışmamıza alınan TİB grubu örneklerde de ko-kültür uygulamalarında başarılı sonuçlar elde edildiği sonucu doğrulanmaktadır.

Bazı araştırmacılar ko-kültür uygulamalarının başarısını ortaya koymak üzere ko-kültür hücreleri arasında ortaya çıkan etkileşimin morfolojik yansımalarını değerlendirmişlerdir^3,19,21. Endometriyumun gland epitel hücreleri ve stromal hücreleri ile salınan sitokinler yoluyla Otolog endometrial ko-kültür (AECC), embriyo kalitesini geliştirir ve implantasyonda önemli bir rol oynar^13,22. Embriyo gelişiminde rol oynayan çeşitli sitokinler ve büyüme faktörlerinin yanı sıra özellikle LIF salınımının başarılı endometrial implantasyonda anahtar rol oynadığı farelerde tesbit edilmiştir²³. Endometrial hücrelerin gelişiminde yavaşlama, embriyo gelişiminde eksiklik olarak fark edilecektir. Tekrarlayan IVF başarısızlığı olan hastalarda; endometriyumun rolünü belirlemek ve geliştirmek için ileri çalışmalar planlanmalıdır. AECC uygulamalarında, endometriyumu histolojik açıdan değerlendirmek faydalı bir bakış açısı getirebilir²⁴.

Son yıllarda bazı araştırmacılar tarafından embriyonun implantasyon başarısının artırılması için alternatif olarak yeni yöntemler denenmektedir. Desai ve arkadaşları, AECC uygulamalarının potansiyel dezavantajları olmaksızın, yeni bir non-kontakt insan endometrial ko-kültür sistemi elde ettiklerini bildirmişlerdir²⁵. Başka bir araştırmacı grubu da, embriyonun endometrial hücrelere tutunma ve invasion aşamalarını açıklayabilmek için yeni bir in vitro implantasyon modeli geliştirdiklerini belirtmişlerdir²⁶. İmplantasyon boyunca endometriyum ovaryan steroidlerin ve spesifik zamanlı çok sayıda sitokin salınımının etkisi altındadır. Endometriyum kaynaklı sinyaller, uyumlu bir şekilde blastosist gelişiminden ve embriyonik sinyallerin aktivasyonundan sorumludur²⁷. Yine son çalışmalarda endometrial ko-kültür sisteminde, IL-6 gibi endometrial epitel hücreleri tarafından salgılanan önemli faktörlerin katkısı göz önüne alınarak, blastosist gelişimi ve implantasyon oranlarında artış gösterilmiştir²⁸.

Bizim çalışmamızda, TİB grubunun endometrial ko-kültür gelişimi incelendiğinde, fertil gruba göre daha az hücre içerdiği gözlenmiş olup, istatiksel analizle de doğrulanmıştır (Tablo 1). Bu durum TİB grubu ko-kültür hücrelerinin, embriyonun gelişimini olumlu yönde etkileyen, fragmantasyonu azaltan ve implantasyonda oluşan başarısızlıkları çözen bazı faydalı yolaklar içerdiğini düşündürmektedir. Endometrial ko-kültür sistemlerinin blastosist gelişimi ve implantasyon üzerine olumlu etkisinin, endometrial epitelyal hücrelerin sekrete ettiği faktörlere bağlı olduğu belirtilmektedir. AECC, TİB grubu hastalarda faydalı sonuçlar vermektedir. Bu sistemdeki hücrelerin morfolojik ve moleküler özelliklerinin iyi bilinmesi için yapılacak yeni çalışmalarla, invivo ortamda implantasyon için endometriyumun yetersiz yapısının tamamlanmasına çözüm bulunmalıdır^18,29. Ancak implantasyon boyunca meydana gelen sinyaller ve bu sinyallerin embriyo ve endometrium arasındaki diyalogta ne şekilde etkili olduğunun yorumuna dair hala birçok bilinmeyen vardır. Sonuç olarak embriyo endometriyum arası etkileşimlerle ilgili olarak bilinmeyen yolakların ortaya konulabilmesi için morfolojik, fizyolojik, ve moleküler açıdan yeni çalışmalara ihtiyaç vardır.