Doksorubusin (Dx), Streptomyches peucetius’un fermantasyonu ile elde edilen antrasiklin antibiyotiklerdendir¹. Tümör tedavisinde geniş spekturumlu bir ajan olması nedeniyle önemli olmakla beraber, toksik yan etkileri ilacın terapötik kullanımını kısıtlamaktadır². Dx ’in kimyasal yapısı, oksidatif stresi artırıp serbest radikallerin oluşmasına ve hücre hasarına yol açmaktadır³. Demir iyonları, plazmada serbest radikal reaksiyonları için katalitik bir etkiye sahip olup Dx’in demir iyonu ile oluşturduğu kompleksin, potansiyel preoksidan etkisi olduğu gösterilmiştir. Bu kompleks, glutatyon veya nikotinamid adenin dinükleotit fosfat (NADPH) bağımlı enzimleri azaltması yanında, serbest radikal oluşum reaksiyonlarını başlatabilmektedir⁴.

Yetişkinlerde büyüme hormonu eksikliğinin oksidatif stresi artırdığı, ancak büyüme hormonu tedavisi ile bu durumun geriye döndüğü bildirilmiştir⁵. Ghrelin, Masayasu Kojima tarafından ilk defa 1999 yılında büyüme hormonu salgılatıcı hormon reseptörü 1a (GHS-R1a)’ya bağlanmış peptit yapıda endojen bir gastrik hormon olarak keşfedilmiş ve endojen kaynaklı güçlü bir büyüme hormonu salgılatıcısı olduğu görülmüştür^6-7. Esas olarak mide mukozasında yer alan endokrin fonksiyonlara sahip P/D1 ve X/A hücreleri tarafından üretilmektedir⁸. Ghrelin’in hipotalamus, pituiter bez, beyin, böbrek, pankreas, kalp, mide ve bağırsak dokularında bulunduğu ve GHS-R 1a reseptörü üzerinden etki ettiği tesbit edilmiştir^9-10.

Ghrelin uygulamasının glutatyon peroksidaz enzim aktivitesini artırarak serbest oksijen radikallerinin oluşumunu azalttığı gösterilmiş olup preadipozit hücre kültürlerinde ve spontan hipertansif sıçanlarda; süperoksit dismutaz, katalaz ve glutatyon peroksidaz enzimlerinin aktivitesini artırdığı, vasküler süperoksit üretimini önlediği bildirilmiştir^11-13.

Bu çalışma ile kliniklerde çeşitli hastalıkların tedavisinde kullanılan Dx’in, dokularda oluşturabileceği hasar karşısında endojen bir antioksidan olan ghrelin’in; karaciğer, kalp ve böbrek dokularında nasıl bir tepki oluşturduğunu immunohistokimyasal yöntemlerle belirlemeyi amaçladık.

Çalışmamızda 8 haftalık erişkin Wistar Albino cinsi erkek sıçanlar kullanıldı. Sıçanlar bulundukları ortamın sıcaklığı 22-25˚C arasında sabit ortamda ve 12 saat ışık, 12 saat karanlıkta takip edildi. Sıçanlar havalandırma sistemi bulunan bir ortamda özel olarak hazırlanmış ve her gün altları temizlenen kafeslerde beslendi. Yemler özel çelik kaplarda, su ise paslanmaz çelik bilyeli biberonlarda normal çeşme suyu olarak verildi. Çalışmanın tüm aşamalarında 1983 Helsinky deklarasyonunda bildirilen “Hayvanlarda Bilimsel Çalışmalar için Etik Kurallar” a uyulmuştur.

Deney hayvanları, daha önceki çalışmalara dayanarak her grupta 7 sıçan olmak üzere 2 gruba ayrıldı.

Grup I (n=7): Kontrol grubu sıçanlara deney süresi olan 14 gün boyunca herhangi bir işlem yapılmadı.

Grup II (n=7): Dx grubu deneklere deneyin ilk günü 10 mg/kg/tek doz Dx intraperitoneal (ip) olarak verildi ve deney sonuna kadar herhangi bir işlem yapılmadı.

Deneyin 15. günü tüm gruplardaki sıçanlar, ketamin (75mg/kg)+xylazine (10mg/kg) intraperitoneal uygulanarak anestezi altında dekapite edildi. Dekapitasyonun ardından sıçanların böbrek, kalp ve karaciğer dokuları hızla çıkarılıp %10 formaldehitle tespit edildi. Takiben histokimyasal incelemeler için parafin bloklar hazırlandı.

Parafin bloklardan 5–6 mm kalınlığındaki kesitler polilizinli lamlara alındıktan sonra deparafinize edilip, dereceli alkol serilerinden geçirildi. Dokular antigen retrieval için sitrat tampon solüsyonunda pH 6’da mikrodalga fırında (750W) 7+5 dakika kaynatıldı. Zemin boyasını önlemek için Ultra V Block (TA-125-UB, Lab Vision Corposıçanion, USA) solüsyonu uygulamasını takiben primer antikor (Ghrelin goat poliklonal IgG, sc-10368, Santa Cruz Biotechnology, California, USA) ile 60 dakika inkübe edildi. Primer antikor uygulanmasından sonra sekonder antikor (30 dakika) (Donkey anti-goat IgG-B, sc-2042), Streptavidin Alkaline Phosphatase (30 dakika) (TS-060-AP, Lab Vision Corposıçanion, USA) ve Fast Red Substrate System (TA-125-AF, Lab Vision Corposıçanion, USA) ile muamele edildi. Mayer’s hematoksilen ile zıt boyaması yapılan dokular PBS (Phosphate Buffered Saline) ve distile sudan geçirilerek uygun kapatma solusyonu ile kapatıldı. Hazırlanan preparatlar Olympus BX 50 mikroskobunda incelenerek değerlendirildi ve fotoğraflandı.

İmmunohistokimyasal Boyama
Karaciğer, kalp ve böbrek dokularında meydana gelen immunpozitifliğin belirlenmesi için immunboyama yapıldı ve gruplar arası sitoplazmik boyamanın derecesi semi-kantitatif olarak değerlendirildi. Skorlama; -, yok; +1, hafif; +2, orta; +3, şiddetli olarak değerlendirildi.

Ghrelin immünreaktivitesi için yapılan immünohis-tokimyasal boyamanın ışık mikroskobik incelenmesi sonucu elde edilen Ghrelin immünreaktivitelerine ait semikantitatif değerler Tablo 1’de; karaciğer, kalp ve böbrek dokularına ait mikroskopik görünümler ise Şekil 1-6’da verilmiştir.

Tablo 1: Gruplara ait karaciğer, kalp ve böbrek dokularında ghrelin immunreaktivitesi semikantitatif analiz değerleri.

Şekil 1: Kontrol grubuna ait karaciğer dokusu ghrelin immunreaktivitesi ayırtedilmekte. 400X.

Şekil 2: Dx grup sıçan karaciğer dokusu ghrelin immunreaktivitesi izlenmekte. 400X.

Şekil 3: Kontrol grubuna ait kalp dokusu ghrelin immunreaktivitesi ayırtedilmekte. 400X.

Şekil 4: Dx grup sıçan kalp dokusu ghrelin immunreaktivitesi gözlenmekte. 400X.

Şekil 5: Kontrol grubuna ait böbrek dokusuna ait ghrelin immunreaktivitesi ayırtedilmekte. 400X.

Şekil 6: Dx grup sıçan böbrek dokusu ghrelin immunreaktivitesi gözlenmekte. 400X.

Mevcut çalışmanın histolojik bulgularına göre, kontrol grubuna ait sıçan karaciğer dokularında özellikle vena sentralis çevresindeki hepatositlerde daha belirgin olmak üzere ghrelin immunreaktivitesi (+2) orta derecede izlenirken, kalp ve böbrek dokularında hafif (+1) olarak ayırtedildi.

Dx grubuna ait karaciğer dokularına ait kesitlerdeki ghrelin hafif (+1) derecede pozitif boyanmasına rağmen, kalp ve böbrek dokusu kesitlerinde immunreaktivite şiddetli (+3) idi ve özellikle böbreğin distal tübüllerinde yoğunlaşmıştı.

Dx geniş spekturumlu antitümöral bir ajan olup tedavide oldukça yaygın kullanıma sahiptir. Ancak toksik yan etkileri, ilacın terapötik kullanımını kısıtlamaktadır². Uzun süreli kullanımı ve doza bağlı olarak özellikle karaciğer, böbrek ve kalp dokusunda toksik etki göstererek bazal metabolizmanın bozulmasına neden olmaktadır¹⁴. Dx’e bağlı oluşan organ toksisitelerinin temel sebebinin oksidatif strese bağlı olduğu ileri sürülmektedir¹⁵. Dx kullanımı sonucu oluşan süperoksit anyonu, hidroksil radikalleri ve hidrojen peroksit gibi reaktif oksijen ürünlerinin organlarda hasara neden olabileceği bilinmektedir¹⁶.

Güçlü bir büyüme hormonu endojen salgılatıcısı olan ghrelin ve reseptörleri; arter, ven, vasküler düz kas hücreleri, böbrek, pankreas, hipotalamus, beyin, hipofiz bezi, mide, bağırsak ve kalp miyosit hücrelerinde bulunmuştur¹⁷. Bu dağılım ghrelinin ve GH (büyüme hormonu) salgılatıcıların çeşitli organlarda birçok fizyolojik roller üstlendiğini göstermektedir. Ghrelin, kardiyovasküler sistemde iskemiye bağlı gelişen pek çok bozukluğa karşı koruyucu etki yapmaktadır¹⁸. Ghrelin hormonu serbest radikalleri ortadan kaldırarak onların kan ve doku düzeylerini azaltabilir¹⁹. Ghrelin’in, iskemiye bağlı artan sitokrom c ve kaspaz 3 salınımını azaltarak apoptotik yolağı inhibe ettiği ve dolayısıyla da apoptozisi önleyerek beyin dokusunun hasarlanmasına engel olduğu tespit edilmiştir²⁰.

Dx karaciğerde histopatolojik olarak; venookluziv hastalık, kronik fibrozis, karaciğer yağlanması, kolestaz ve hepatoselüler fonksiyon bozukluğuna neden olabilmektedir²¹. Karaciğer hastalıkları üzerine ghrelin’in etkilerini araştıran pek çok çalışma, bu peptidin, karaciğer hasarında hafifletici bir rol oynadığını göstermektedir²². Ghrelin, nötrofil inhibisyonu yanında Tümör Nekrotizan Faktör-α (TNF-α), İnterlökin1 β (IL-1β) ve İnterlökin-6 (IL-6)’nın ekspresyonunu azaltarak parsiyel karaciğer rezeksiyonu sonucu oluşan iskemik hasarın göstergeleri olan aspartat aminotransferaz (AST), alanin aminotransferaz (ALT), laktat dehidrogenaz (LDH), malondialdehit (MDA) seviyelerini olumlu yönde etkilemektedir²². Xu ve arkadaşları²³, ghrelin’in TNF-α/NF-kB (Nuclear Factor kappa B) yolakları ve mitokondrial koruma mekanizmaları ile Dx’in oluşturduğu kardiyotoksisiteye karşı MDA ve LDH aktivitelerindeki artışı azaltarak koruyucu etki yaptığını göstermişlerdi. Ghrelin’in dolaşımda çok düşük dansiteli lipoprotein (VHDL) ve yüksek dansiteli lipoprotein (HDL) ile taşındığı bilinmektedir²⁴. Bu çalışmada, Dx grubu karaciğer dokularındaki ghrelin ekspresyonu, kontrol grubu ile kıyaslandığında, büyük ölçüde azalmıştı. Bu azalmanın muhtemel sebebinin karaciğer hasarına bağlı olarak VHDL ve HDL’nin yapımının azalmasına bağlı olarak periferik dokulardan karaciğere ghrelin’in taşınmasının azaldığı yönündedir.

Dx’e bağlı kardiyotoksisite de, kan basıncı ve EKG değişiklikleri gibi hafif semptomlar görülebileceği gibi konjestif kalp yetmezliği, disritmi, miyokardit, perikardit ve kardiyomiyopati gibi ağır bulgular da görülebilir²⁵. Histopatolojik olarak ise miyokard liflerinde şişme, intertisiyel ödem, disorganizasyon, nekroz ve vakuolizasyon görülebilir²⁶. Dx, kalp dokusunda apoptotik etkilere sebep olmaktadır²⁷. Ghrelin ise in vitro olarak endotel hücreleri ve kardiyomiyositlerin apoptozisini baskılamakta ve sol ventrikül disfonksiyonunu düzeltmektedir²⁷. Sentetik ghrelin analoglarının verildiği kalp yetmezliği olan hastalarda ghrelin’in, olumlu etkilere sebep olduğu gösterilmiştir²⁸. Yine ghrelin hem vazodilatasyon yaparak, hemde miyokardiyal kontraktiliteyi artırarak, miyokard hasarına bağlı patolojilerde olumlu bir etki yapmaktadır²⁹. İntravenöz ghrelin enjeksiyonu sonrası kan basıncının düşmeden kardiyak atım hızının düştüğü ancak kardiyak çıkışın arttığı görülmüştür¹⁰. Ghrelin, arterlerdeki endotelin-1’in vazakonstriktif etkisini de ortadan kaldırmaktadır²⁷. Ghrelin'in kardiyovasküler sistem üzerindeki protektif etkilerinin fosfatidil kinaz inhibisyonu yoluyla kardiyak inflamasyonu engellemesi şeklinde olduğu yönündedir³⁰. Sıçanlar üzerinde yapılan başka bir çalışmada uzun süreli ghrelin tedavisinin artan böbrek nitrik oksit (NO) üretimi ile ilişkili diüretik etkisi sonucu, tuz bağımlı hipertansiyonu dengeleyerek kardiyo-protektif etki yaptığını göstermiştir³¹. Yaptığımız çalışmada, kontrol grubu ile kıyaslandığında Dx grubu sıçanların kalp dokularındaki ghrelin immunreaktivitesinin anlamlı oranda arttığı görüldü. Doksorubusin grubu kalp dokularında ghrelin immunreaktivitesinin artma sebebinin, Dx’e bağlı gelişebilecek kalp hasarına karşı ghrelin’in koruyucu etki yapmasının sonucu olabilir.

Dx böbrekler üzerinde de çeşitli değişikliklere sebep olur ki bunlar; hemorajik sistit, oligüri, dizüri, kreatininde yükselme, hiperürisemi şeklinde gelişebilir³². Histopatolojik olarak ise böbrekte glomerüler kapiller permeabilitesinde artış ve tübüler atrofi meydana getirmektedir³³. Değişikliklerin ortak sebebi, serbest oksijen radikalleri (SOR)’nin oluşumu ve lipit peroksidasyonudur³⁴. Ghrelin böbrek dokularından da salgılanan bir peptit hormondur. Daha önceki çalışmalar, böbreklerden yüksek miktarda; hatta ilk tesbit edildiği doku olan mide dokusundan bile daha fazla ghrelin sentezlendiğini göstermiştir³⁵.

İntravenöz ghrelin enjeksiyonu kan basıncını düşürüp, kardiak çıkışı artırmaktadır¹⁰. Sıçanlarda nükleus traktus soliterii’ye intracerebroventriküler ghrelin enjeksiyonu sonrası sempatik aktivitenin baskılanarak kan basıncının ve kalp hızının düştüğü görülmüştür³⁶ Bu durumun böbrekler üzerinde olumlu etkiye sebep olacağı bilinmektedir. Mevcut bilgiler ışığında Dx uygulamasına bağlı artmış oksidan strese karşı, antioksidan özelliği olan ghrelin’in böbrek dokusunu korumaya yönelik olarak ve ayrıca Dx uygulamasına bağlı azalmış glomerüler filtrasyon hızı (GFR) sonucu oluşabilecek bir hipertansif atağa karşı da, koruyucu amaçlı olarak arttığı yönündedir.

Sonuç olarak, ghrelin immunoreaktivitesinin Dx grubu kalp ve böbrek dokularında artma sebebinin, Dx uygulaması sonucu oluşan oksidan hasara karşı ghrelin’in koruyucu amaçlı arttığı şeklindedir. Ancak hastalık grubu KC dokularında ghrelin ekspresyonunun kalp ve böbrek dokularının tersine azalmış olarak tesbit edilmesi ise ghrelin taşıyıcı yağ asitlerindeki düşme gibi metabolik etkileşimden dolayı olduğu yönündedir. Mevcut bilgilerin ışığında, oksidatif stres ve lipid profilinin birlikte değerlendirileceği daha kapsamlı çalışmaların yapılmasına ihtiyaç olduğu kanaatine varılmıştır.