Coronavirus hastalığı-2019 (COVID-19) Uluslararası Virüs Taksonomi Komitesi tarafından ciddi akut solunum sendromu Coronavirus-2 (SARS-CoV-2) olarak adlandırılan bulaşıcı bir hastalıktır ^3,4. COVID-19 vaka sayılarının hızla yükselmesi, tedavide yeni ilaçların kullanımı ve eşlik eden komplikasyonlar nedeniyle ilaç kaynaklı sorunlarda artış görülmektedir. İlaç kaynaklı sorunlar için önemli risk faktörleri arasında çoklu ilaç kullanımı, ilaçların renal eliminasyonun bozulması, tedavide terapötik aralığı dar ilaçlar ile antikoagülan veya diüretik bulunması ve hasta yaşının 65'in üzerinde olması yer almaktadır. Viral replikasyonu bloke eden bir ribonükleik asit (RNA) polimeraz inhibitörü olan favipiravir ile güçlü antiinflamatuar ve antifibrotik etkili bir kortikosteroid olan deksametazon COVID-19 tedavisinde kombine halde kullanılabilmektedir ⁵.

Favipiravir, sınırlı veriler doğrultusunda düşük yan etki profili (bulantı, kusma, gaz artışı, diyare, göğüs ağrısı, psikiyatrik semptomlar, karaciğer fonksiyon bozukluğu ve total bilirubin düzeylerinde artış, nötrofil düzeyinde azalma, hiperürisemi) sergilemekte olup, literetürde favipiravir ve deksametazonun birlikte kullanımının sıçanlarda over dokusu ve üreme fonksiyonuna etkisine dair çalışmaya rastlanmamıştır. Bu nedenle çalışmamızın amacı, sıçanlarda favipiravir ve deksametazonun tek başına ve kombine halde over dokusu ve üreme fonksiyonuna etkisini biyokimyasal ve histopatolojik olarak araştırmaktır.

Deneyde kullanılan, favipiravir tablet formu (Türkiye), deksametazon ampul enjeksiyonluk form Sağlık Bakanlığı'na bağlı hastaneden (Türkiye) ve tiyopental sodium İE Ulagay'dan (Türkiye) temin edildi. Deneyde kullanılan ratlar; favipiravir uygulanan (FPR), deksametazon (DEKSA) uygulanan, favipiravir + deksametazon (FDA) uygulanan ve sağlıklı kontrol (SG) gruplarına ayrıldı. Bu deneyin tatbiki için FPR (n-8) grubuna favipiravir 100 mg/kg dozda sonda ile oral yoldan mideye verildi. DEKSA grubuna (n-8) 8 mg/kg dozda deksametazon intraperitoneal (i.p.) yoldan enjekte edildi. FDA grubuna ise 100 mg/kg favipiravir (n-8) + 8 mg/kg dozda deksametazon (n-8) aynı yoldan uygulandı. SG hayvan grubuna çözücü olarak aynı hacimde distile su verildi. Favipiravir günde iki defa, deksametazon ise bir defa verildi. Bu prosedür bir hafta boyunca tekrarlandı. Deney süresince her gün, bir kez smear alınarak östrus fazları takip edildi. Vajinal smear yöntemi; farelerin vajinasına distile su verildi ve bu sıvı geri alınarak lama yayıldı, ışık mikroskobunda değerlendirildi. Bu süre sonunda hayvanlar yüksek doz tiyopental sodyum anestezisi ile (30 mg/kg) uyutuldu ve AMH seviyesini araştırmak için kalpten kan örnekleri alındı. Alınan kan örnekleri 3000 devir/dk da 15 dakika santrifüj edildi ve serumları ayrıştırıldı. Biyokimyasal tetkik yapılana kadar -20 C'de saklandı. Daha sonra dekapitasyonla öldürülen hayvanların over dokuları çıkartıldı. Çıkarılan over dokusu biyokimyasal ve histopatolojik olarak araştırıldı. FPR, DEKSA ve FDA gruplarından elde edilen biyokimyasal ve histopatolojik sonuçlar SG grubundan elde edilen sonuçlarla karşılaştırıldı.

Biyokimyasal analizler

1. AMH Ölçümü
Hayvanlardan elde edilen serum örneklerinde AMH düzeyleri, rat AMH (Hangzhou Eastbiopharm Co. Ltd. Hangzhoui, CHINA) kitiyle, Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay testi (ELISA) yöntemi kullanılarak ölçüldü. Prospektüste kitin analitik duyarlılığı 0,05 ng/mL ve analiz sınırları 0.1-40 ng/mL olarak bildirilmekteydi.

2. Doku Malondialdehid (MDA) ve Total Glutatyon (tGSH) analizi
Over dokusunda MDA tayini için % 1.15'lik potasyum klorür çözeltisi, tGSH ölçümü için pH=7.5 olan fosfat tamponu içinde 2 mL'ye tamamlanarak buzlu ortamda homojenize edildi. Daha sonra +4 °C'de 10000 rpm'de 15 dakika santrifüj edildi. Süpernatant kısmı analiz numunesi olarak kullanıldı.

-Doku MDA miktar tayini
MDA ölçümü için, Ohkawa H ve ark.'nın ⁶ kullandıkları yöntem esas alındı. Bu yöntem, yüksek sıcaklıkta (95 °C'de) tiyobarbitürik asit (TBA) ile MDA'nın oluşturduğu pembe renkli kompleksin absorbansının 532 nm dalga boyunda spektrofotometrik olarak ölçülmesi esasına dayanır. Homojenatlar, 5000 g'de 20 dakika santrifüj edildi ve bu süpernatantlar, MDA miktarının belirlenmesinde kullanıldı. Kapaklı deney tüpleri içerisine 250 μl homojenat, 100 μl % 8 sodyum dodesil sülfat (SDS), 750 μl % 20 asetik asit, 750 μl % 0.08 TBA ve 150 μl saf su pipetlenerek vortekslendi. Karışım 100 oC'de 60 dakika inkübasyona bırakıldıktan sonra üzerine 2,5 ml n-bütanol ilave edildi ve spektrofotometrik olarak ölçüm yapıldı. Oluşan kırmızı renk miktarları 532 nm'de 3 ml'lik küvetler kullanılarak okundu ve seyreltme katsayıları dikkate alınarak önceden hazırlanan MDA stok çözeltisi kullanılarak oluşturulan standart grafikten yararlanarak numunelerin MDA miktarı belirlendi.

-Doku tGSH miktar tayini
Ölçüm ortamındaki DTNB (5,5'-Ditiyobis (2-nitrobenzoik asit)) disülfit bir kromojendir ve sülfidril gruplu bileşikler tarafından kolayca indirgenmektedir. Meydana gelen sarı renk 412 nm spektrofotometrik olarak ölçüldü. Homojenatlar, 12000 g'de 10 dakika santrifüj edildi ve süpernatantlar, Glutatyon (GSH) miktarının belirlenmesinde kullanıldı. Kapaklı deney tüpleri içerisine 1500 μl ölçüm tamponu (0,2 mM etilendiamin tetraasetik asit (EDTA) içeren 200 mM Tris-HCl, pH=8,2), 500 μl süpernatant, 100 μl 5,5'-Dithio-bis (2-nitrobenzoic acid) (DTNB) ve 7900 μl metanol pipetlenerek vortekslendi. Karışım 37oC'de 30 dakika inkübasyona bırakıldı ve sonra spektrofotometre ile ölçümler yapıldı. Oluşan sarı renk miktarları 412 nm'de 3 ml'lik kuartz küvetler kullanılarak okundu ve seyreltme katsayıları dikkate alınarak önceden hazırlanan GSH stok çözeltisi kullanılarak oluşturulan standart grafikten yararlanılarak numunelerin GSH miktarı belirlendi ⁷.

3. Histopatolojik inceleme
Histopatolojik değerlendirme için ovaryum %10'luk formalin solüsyonu içerisinde tespit edildi. Rutin histolojik doku takip aşamalarından geçirildikten sonra parafine gömüldü. Mikrotomda 5µm kalınlığında kesitler alındı. Alınan kesitler Hematoksilen-Eozin (HE) boyası ile boyandıktan sonra ışık mikroskobu ile incelendi (Olympus BX53, Japan). Histopatolojik değerlendirme için gruplardaki her hayvan için rastgele örnekleme yapılarak ortalama 15-17 alanda değerlendirme yapıldı. Bulgular semikantitatif olarak değerlendirildi. Bulgular, incelenen bölgelerde gözlenen hasar derecesine göre semikantitatif olarak değerlendirildi. Buna göre: (-) (normal doku), çok az hasar: (+) (hasar < % 25), az hasar: (++) (% 25-50), orta hasar: (+++) (% 50-75), şiddetli hasar: (++++) (hasar > %75) şeklinde değerlendirildi.

4. Stereoloji
Stereolojik değerlendirme için mikrotomda 5 µm kalınlığında ardışık kesitler alındı. İlk kesit çifti rastgele seçilerek diğer kesit çiftleri ise sistematik olarak her 20. adımda bir alındı. Böylece her doku bloğundan 12-17 arasında kesit çifti alınmış oldu. Lam üzerine alınan doku çiftleri HE boyası ile boyandıktan sonra ışık mikroskobunda incelenmeye alındı. Dokunun toplam hacmi için Cavalieri Prensibi, folikül sayımı için fiziksel disektör sayım metodu uygulandı. Dokunun hacmi hesaplamak için şu formül kullanıldı; Vref = ∑P. a(p).t (∑P: Yapıya denk gelen toplam nokta sayısı, a(p): Bir noktanın kapladığı alan, t: Kesit kalınlığı). Toplam primordiyal folikül sayısı hesaplamak için kullanılan formül; N = Nv. Vref (N: Toplam folikül sayısı, Nv: Foliküllerin sayısal yoğunluğu, Vref: Dokunun toplam hacmi). Hücre sayısal yoğunluğunu hesaplamak için kullanılan formülde; ∑Ǭ: Toplam disektör hücre sayısı, Vdis: Toplam disektör hacmidir. Hesaplamalarda kullanılan formüller Şekil 6'da gösterilmiştir.

Şekil 6: Doku hacmi (Vref), toplam folikül sayısı (N) ve hücre sayısal yoğunluğu (Nv) hesaplamalarında kullanılan formüller.

5. İstatistiksel Analizler
Deneylerden elde edilen sonuçlar "ortalama değer ± standart sapma" (x ± SEM) olarak ifade edildi. Gruplar arası farkın önemlilik derecesi tek yönlü varyans analizi (one-way ANOVA) testi kullanılarak belirlendi. Takibinde Fisher's post-hoc LSD (least significant differences) yapıldı. Post-hoc test olarak varyanslar homojen olduğu için Tukey testi kullanıldı. Tüm istatistiksel işlemler "SPSS for Windows, 18.0" istatistik programında yapıldı ve p <0.05 değeri anlamlı olarak kabul edildi.

1. AMH Ölçüm Sonuçları
Çalışma gruplarından elde edilen AMH (Antimüllerian Hormon) verileri değerlendirildiğinde, en az bir grubun istatistiksel olarak farklı olduğu bulunmuştur. Şekil 1'den de görüldüğü gibi, FPR (0,236 ± 0,008) grubundaki AMH düzeyleri, SG (0,339 ± 0,059) grubuna göre anlamlı şekilde daha düşük ölçülmüştür (p < 0,001).

Şekil 1: SG, FPR, DEKSA ve FDA gruplarında AMH düzeylerinin karşılaştırılması. SG: Sağlıklı grup, FPR: Favipiravir verilen grup, DEKSA: Deksametazon verilen grup, FDA: Favipirapir + Deksametazon verilen grup.

Ayrıca, DEKSA grubundaki AMH düzeyleri (0,315±0,018), FPR grubuna göre anlamlı derecede daha yüksek bulunmuş (p <0,001), ancak SG grubuyla karşılaştırıldığında anlamlı bir fark göstermemiştir (p >0,05). FDA grubundaki AMH düzeyleri (0,270±0,026), SG grubuna göre daha düşük, ancak FPR grubuna göre daha yüksek bulunmuştur (p <0,001). Sonuç olarak, FPR grubundaki AMH düzeylerinin en düşük, SG grubundaki düzeylerin ise en yüksek olduğu belirlenmiştir (Veriler normal dağıldığı için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ile karşılaştırmalar gerçekleştirildi. Post-hoc test olarak varyanslar homojen olmadığı için Games-Howell testi kullanıldı.).

2. Doku Malondialdehid (MDA) ve Total Glutatyon (tGSH) analizi sonuçları
Çalışmamızda, oksidatif stres parametreleri olan MDA ve tGSH seviyeleri gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar göstermiştir. MDA düzeyleri değerlendirildiğinde, FDA grubunda (9.23±0.48) MDA seviyeleri, SG grubuna (1.56±0.30) kıyasla anlamlı derecede yüksek bulunmuştur (p <0.001). Ayrıca, FPR (3.42±0.30) ve DEKSA (1.72±0.28) gruplarında da MDA seviyeleri SG grubuna göre artış göstermiştir (p <0.001). FDA grubundaki MDA düzeyleri, FPR ve DEKSA gruplarına göre de anlamlı şekilde yüksek bulunmuştur (p <0.001). tGSH seviyeleri incelendiğinde, FDA grubunda (1.45±0.24) tGSH seviyelerinin SG grubuna (6.88±0.40) kıyasla anlamlı derecede düşük olduğu gözlemlenmiştir (p <0.001). FPR (3.58±0.31) ve DEKSA (6.59±0.42) gruplarında da tGSH seviyeleri SG grubuna göre azalmıştır (p <0.001). Ayrıca, FDA grubunda tGSH seviyeleri, FPR grubuna kıyasla daha belirgin bir azalma göstermiştir (p <0.001). Bu bulgular, oksidatif stres göstergelerinin farklı gruplarda önemli değişiklikler gösterdiğini ve FDA grubunda en yüksek MDA seviyeleri ile en düşük tGSH seviyelerinin bulunduğunu ortaya koymaktadır. Şekil 2'de gruplara ait MDA ve tGSH düzeyleri görülmektedir (Veriler normal dağıldığı için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ile karşılaştırmalar gerçekleştirildi. Post-hoc test olarak varyanslar homojen olduğu için Tukey testi kullanıldı.).

Şekil 2: Gruplar arasında MDA ve tGSH düzeylerinin karşılaştırılması. SG: Sağlıklı grup, FPR: Favipiravir verilen grup, DEKSA: Deksametazon verilen grup, FDA: Favipirapir + Deksametazon verilen grup.

3. Histopatolojik ve Stereolojik Bulgular
Kontrol grubu normal histolojik yapıda olduğu gözlendi. FPR grubunda foliküler hücre bütünlüğünün bozulduğu ve fibrotik alanların arttığı gözlendi. DEKSA grubunda kontrol grubuna göre kortikal alanda bağ doku artışı gözlendi. FDA grubunda kontrol grubuna göre primordiyal foliküllerin azaldığı ve atretik foliküllerin arttığı, korteks/medulla oranında artış ve folikül hücrelerinde dejenerasyon gözlendi. Her dört gruptaki ratların over dokularına ait histopatolojik görüntüler Şekil 3, 4'te verilmiştir.

Şekil 3: A. SG, ince ok primordiyal folikül, kesikli ok: damar. H-E. 20x. B. FPR, Yıldız: Fibröz bağ dokusu, Kalın ok: Foliküler hücre deformasyonu. H-E. 20x.

Şekil 4: A. DEKSA grubu. H-E. 20x. B. FDA grubu. Kavisli ok: Dejenerasyon, ok başı: Atretik folikül. H-E. 20x.

Çalışma gruplarında stereolojik ölçümler yapılmış ve primordiyal folikül sayısı, korteks hacmi, medulla hacmine ait tanımlayıcı istatistikler Tablo 1'de sunulmuştur.

Tablo 1: Ovaryuma ait stereolojik bulgular.

Gruplarda primordiyal folikül sayısı karşılaştırıldığında, FPR ve DEKSA grubunda SG'a göre daha düşük sayıda folikül görülmesine rağmen farklılık istatistiksel olarak anlamlı değildi (sırasıyla p =0,075; p =0,293). Fakat kombinasyon uygulanan grupta (FDA) SG'a göre düşük folikül sayısına rastlanmıştır (p <0,001) (Şekil 5A).

Şekil 5A: Sırasıyla SG, FPR, DEKSA ve FDA gruplarında primordiyal folikül sayısının karşılaştırılması.

Korteks hacmi incelendiğinde, FPR grubunda hacim SG ile benzer düzeyde görüldü (p =0,812). DEKSA ve kombinasyon gruplarında ise hacim SG'a göre daha düşüktü (sırasıyla p =0,012; p <0,001) (Şekil 5B).

Şekil 5B: Korteks hacminin karşılaştırılması.

Medulla hacmi ölçümleri karşılaştırıldığında tüm ilaç gruplarında SG'a göre yüksek hacme rastlandı (sırasıyla p <0,001; p <0,001; p <0,001) (Şekil 5C).

Şekil 5C: Medulla hacminin karşılaştırılması.

SARS-CoV2'nin tedavisinde kullanılan ilaçların etkileri ve yan etkileri ile ilgili çalışmalar yapılmış olsa da favipiravir ve deksametazonun dişi üreme sistemi ve ovaryan rezerv üzerindeki kombine etkileri ile ilgili az sayıda çalışma bulunmaktadır. Bu çalışmada COVID-19 tedavisinde tek başına veya kombine halde kullanılabilen favipiravir ve deksametazonun dişi sıçanların over rezervine ve üreme fonksiyonuna etkisini biyokimyasal ve histopatolojik olarak araştırmayı amaçladık.

Favipiravir; bir ribonükleik asit (RNA) polimeraz inhibitörü olup, birçok RNA virüsüne etkilidir. National Medical Products Administration of China tarafından, Mart-2020 tarihinde favipiravir, minimal yan etkili ilk anti-COVID-19 ilaç olarak onaylanmıştır ¹⁷. Favipiravir, sınırlı veriler doğrultusunda düşük yan etki profili sergilemekte olup, şimdiye kadar bildirilen yan etkiler arasında bulantı, kusma, gaz artışı, diyare, döküntü göğüs ağrısı, psikiyatrik semptomlar, karaciğer fonksiyon bozukluğu, nötrofil düzeyinde azalma ve hiperürisemi bulunmaktadır ^18,19. COVID-19 enfeksiyonunda favipiravirin yüksek dozlarda kullanımı önerilmektedir ancak favipiravir yüksek dozlarda daha ciddi yan etkilere neden olmaktadır ^20,21. Balcı ve ark.'nın ²² yaptığı çalışmada düşük (100 mg/kg) ve yüksek doz (400 mg/kg) favipiravirin dişi sıçanlarda yumurtalık ve üreme fonksiyonları üzerindeki etkilerini araştırılmış ve favipiravir yüksek dozlarda hayvanların yumurtalık dokusunda daha şiddetli oksidatif hasara neden olduğu görülmüştür. Düşük doz favipiravir uygulanan hayvanların bir kısmında kısırlık gelişmiş, yüksek doz favipiravir ile tedavi edilen tüm hayvanlarda kısırlık gözlenmiştir. Sonuç olarak çalışmamızla uyumlu şekilde, favipiravirin yumurtalık dokusu ve üreme fonksiyonu üzerindeki olumsuz etkisi ilk kez ortaya konmuştur. Çalışmamızda favipiravir uygulanan deney grubunda AMH ve tGSH düzeylerinin ve folikül sayısının sağlıklı gruba göre daha düşük, MDA düzeylerinin ise daha yüksek olduğu görülmüştür. Ayrıca FPR grubunda foliküler hücre bütünlüğünün bozulduğu ve fibrotik alanların arttığı gözlenmiştir.

High-flow oksijen takviyesi veya ventilatör desteği alan veya Ekstrakorporal Membran Oksijenizasyon (ECMO) yapılan COVID-19 hastaları için kortikosteroidler önerilmektedir. Güçlü antiinflamatuar ve antifibrotik etkili olan deksametazon düşük dozda kullanıldığında pulmoner ve sistemik inflamasyonun çözümünü hızlandırmaktadır. Uzun süredir alerji, astım ve inflamasyon tedavisinde kullanılan deksametazonun 6000'den fazla hasta gönüllünün dahil edildiği bir çalışmada COVID-19 nedenli ölümleri azalttığına ilişkin kanıtlar bulunmaktadır ^23,24. COVID-19 hastalarında deksametazon tedavisinin en önemli kısıtlamalarından biri viral klirense etkisidir. İki büyük meta-analize göre, bazı çalışmalarda deksametazonun viral klirenste uzamaya yol açtığı, bazılarında değişmediği, az sayıda çalışmada ise kısaldığı görülmüştür. Bunun yanında sekonder enfeksiyon gelişimi, hiperglisemi, hipertansiyon, psikoz ve heparin birlikte uygulandığında gastrointestinal kanama riskinin artması gibi yan etkiler de görülebilmektedir ^25,26.

Er ve ark. ²⁷ koçlarda deksametazonun kandaki oksidatif duruma etkisini araştırmışlar ve cilt altına tek doz deksametazon (0.5 mg/kg) uygulamasının ilk 24 saat içinde serum oksidan seviyelerini azalttığını belirtmişlerdir. Ancak mevcut araştırmada deksametazon uygulamasının serum oksidan düzeylerinde istatistiki düzeyde olmayan dalgalanmalara neden olduğunu belirlemişlerdir (p >0.05). İlacın ratlarda MDA düzeyini düşürücü etkisi olduğu bildirilmesine ²⁸ rağmen, invitro şartlarda gelişen oksidatif stresi engelleyemediğini ²⁹ ve kontrol grubu ile karşılaştırıldığında rat mide dokusu MDA düzeyini artırdığını gösteren ³⁰ çalışmalar bulunmaktadır. Bu çalışmalarda deksametazonun oksidatif stres üzerine etkisinin uygulama dozuna, seçilen oksidatif stres parametre türüne, gelişen oksidatif stresin şiddetine ve hayvan türüne göre değişiklik gösterebileceği ifade edilmiştir.

Gong ve ark.'nın ³¹ 2021 yılında Çin'de yaptığı bir rat çalışmasında prenatal deksametazon maruziyeti (PDM)'nin, dişi yavrular üzerinde uzun süreli üreme toksisitesine neden olabileceği ve maternal hat yoluyla nesiller arası aktarılabileceği gösterilmiştir.

Çalışmamızda deksametazon uygulanan grupta AMH, MDA ve tGSH düzeylerinin SG ile benzer olduğu, dolayısıyla tek başına deksametazonun over rezervine ve oksidan parametrelere belirgin etkisi olmadığı ancak kontrol grubuna göre overlerde kortikal alanda bağ doku artışına neden olduğu gözlenmiştir. Literatürde deksametazonun favipiravirle kombine halde over rezervine biyokimyasal veya histopatolojik etkisiyle ilgili bir çalışma bulunamamıştır. Çalışmamızda FDA grubunda deksametazonun, favipiravirin over rezervine olan olumsuz etkisini azalttığı düşünülmüştür. Bu durumun aksine FDA grubunda diğer gruplara göre oksidan içeriği artmış, antioksidan aktivite azalmış, dolayısıyla AMH'da görülenin tersine deksametazon, oksidan ve antioksidan sistemlerde favipiravirin olumsuz etkisini artırıcı etki göstermiştir. Yine bu grupta kontrol grubuna göre primordiyal foliküllerin azaldığı ve atretik foliküllerin arttığı, korteks/medulla oranında artış ve folikül hücrelerinde dejenerasyon gözlenmiştir.