Halotanın %20’si hepatositlerde monooksijenaz enzim sistemi ve sitokrom p-450 ile oksidatif ve redüktif yolla endoplazmik retikulumda günler/haftalarda metabolize edilir. Hepatositlerdeki lipid peroksidasyonu ile hiperoksidler oluşup, reaktif metabolitlere dönüşür. Oluşan metabolitler ve serbest radikaller doku hasarına neden olurlar ^1,2,3. Oksidatif biyotransformasyon ile oluşan trifluroasetik asid karaciğerin sentrilobuler nekrozundan sorumlu olarak gösterilmektedir ^4,5. Malonildialdehid (MDA) lipid peroksidasyonun göstergesi olup, miktarı toksisiteyle paraleldir. Karaciğerde sentezlenen tüm proteinlerin sentezi anesteziklerden en fazla halotan tarafından baskılanmaktadır ^2,6,7,8,9.

Rat karaciğeri ve plazmasında yüksek oranda bulunan paraoksonaz (PON1, arildialkilfosfataz, EC.3.1.8.1), 43 kDa’luk ve 354 aminoasidden oluşan glikoprotein yapısındaki doğal antioksidan enzimdir. Sentez ve salınımı karaciğer tarafından yapılmaktadır ^{10,11,12,13,14}. Bir insektisit olan parationun toksik bir metaboliti olan paraoksonu hidrolize edebilme yeteneği nedeniyle bu isimle anılmıştır ¹⁵. Ateroskleroz oluşumunda yüksek dansiteli lipoproteinler ile PON1 arasında sıkı ve paralel ilişki olduğu belirlenmiştir. Kronik karaciğer hastalığı, diabetes mellitus ve sigara içenlerde bu enzim düşük bulunmuştur ^{10,11,16,17,18}. Halotan ile oluşan akut karaciğer hasarının belirlenmesinde ucuz, basit, kolay, hızlı ve önemli bir gösterge olması nedeniyle PON 1 aktivitesi ile halotanın karaciğere etkisi arasındaki ilişkinin biyokimyasal ve histopatolojik varlığı amaçlanmıştır.

Yerel Etik Kurul (F.Ü. tıp Fakültesi Etik Kurul) onayından sonra ağırlığı 180-200 gram arasında değişen 70 rat (wistar) çalışmaya alındı. Randomize ve kör çalışma olarak yapılan planlamada ratlardan rastgele seçilmiş 10 tanesi çalışmanın ilk gününde kontrol grubunu oluşturdu (Grup I). Geride kalan 60 rata 40x40x70 cm boyutlarındaki bir fanus içinde halotan ile (%1.5 oranında %100 oksijen içinde) 2 saat süreyle anestezik karışım uygulandı (Draeger Cato Edition, Lübeck, Germany). Ortamın anestezik gaz monitörizasyonu anestezi gaz monitöründen sürekli olarak izlendi. Ratlardan 10 tanesi (Grup II) anesteziden hemen sonra dekapitasyonla sakrifiye edildi. İlk halotan uygulamasından sonraki 3. ve 5. günlerde kalan ratlara aynı uygulama tekrarlandı. Böylece her uygulama öncesi ve sonrasında 10’ar rattan oluşan gruplar (Grup II, IV, V ve VI) oluşturuldu. En son kalan 10 rat (Grup VII) çalışmanın 12. gününde benzer şekilde sakrifiye edildi. Sakrifiye edilen tüm ratlardan hızla ve travmatize etmeksizin karaciğerleri alınıp %10’luk formalin solusyonuna kondu. Aynı zamanda injektör ile kan örneği alındı. Serum PON 1 ve MDA ölçümü yapılmak üzere kodlanarak –20 C º’de saklandı.

Çalışmadan habersiz çalışmacılar Biyokimya laboratuvarında Olympus 600 Autoanalyzer (Olympus Optical Co. LTD. Shizuoka-ken, Japan) ticari kiti ile serumda PON 1 ve MDA, düzeylerini ölçtüler. PON 1 için Ruiz ve ark ¹⁹ ile Juretic ve ark ²⁰ tarafından belirlenmiş metota uygun yöntem kullanıldı. MDA ölçümü için ise Loeper ve ark ²¹ tarafından belirlenmiş metota uygun (Schimadzu UV-1201 spectrophotometer) olarak 532 nm’de spektrofotometrik yöntem kullanıldı. Kan örneği ile eş zamanlı alınan karaciğerlerin histopatolojik incelemesi grupları bilmeyen veteriner patologlar tarafından yapıldı. %10 formalin solüsyonu içinde saklanan organların önce makroskopik, sonra parafin bloktan yapılan 5 µ’luk kesitlerinin hematoksilen eozin boyası ile boyanmasını takiben mikroskopik incelemesi yapıldı. Işık mikroskobunda 10x20x40 büyütme ile histopatolojik değerlendirme yapıldı. Karaciğerin histopatolojik değerlendirilmesinde nekroz/nekrobiyoz, dejenerasyon, fokal nekroz, hücre infiltrasyonu, Kupffer hücre aktivasyonu ve sinuzoidal konjesyon varlığı göz önüne alındı. Saptanan bu lezyonların derecesi 0 (lezyon yok) 1 (hafif), 2 (orta) ve 3 (şiddetli) olarak skorlandı. Laboratuvar sonuçları ve histopatolojik sonuçlar istatistiksel olarak değerlendirildi. Bulguların özeti ortalama±SD olarak verildi. İstatistiksel değerlendirmede multivariate ANOVA (M-ANOVA) Wilk’s Lambda testi kullanıldı. Anlamlı bulunan gruplarda parametrelerin değişiminin değerlendirilmesinde Post-hoc testlerden Tukey testi kullanıldı. P<0.05 anlamlı olarak kabul edildi.

Çalışmada elde edilen sonuçlar Tablo 1’de özetlenmiştir. PON 1 ve histopatolojik hasar arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı (p=0.000) idi. Uygulama gruplarındaki histopatolojik hasar varlığı dikkate alınarak yapılan karşılaştırmada Grup IIGrup IV için (p=0.032), Grup II–Grup V için (p=0.006), Grup II–Grup VII için (p=0.012), Grup III-Grup VI için (p=0.023) ve Grup III-Grup VII için (p=0.044) bulundu. Kontrol grubunun dışında yer alan tüm deneklerde tekrarlanan halotan uygulamalarıyla artan bir histopatolojik hasarlanma görülmüştür (Tablo 1, Tablo 2). Deneklerden uygulama öncesi gruplarda (Grup III ve Grup V) yer alanların PON 1 düzeyleri, uygulama sonrası grupların (Grup IV ve Grup VI) değerleriyle kıyaslandığında artış bulunmaktadır.

Grupların biyokimyasal (Ort.±SD) ve histopatolojik hasar verileri

Deneklerdeki histopatolojik bulguların dağılımı

PON 1 ve MDA arasındaki ilişki istatistiksel olarak anlamlı (p=0.000) idi. MDA için gruplar arası istatistik değerlendirmede Grup I ve Grup VII (p=0.038), Grup II–Grup VII (p=0.048), Grup III-Grup VII (p=0.006), Grup IV-Grup VII (p=0.014), Grup V-Grup VII (p=0.048) ve Grup VI-Grup VII (p=0.027) şeklinde olup anlamlı (p<0.05 ) idi. PON 1 ve MDA düzeylerinin seyri çalışılan tüm deneklerde tamamen ters gidişat göstermiştir.

Histopatolojik hasar ve MDA arasındaki ilişkiye bakıldığında her iki parametrenin artış ve azalışları paralel bir seyir izlemekte olup, istatistiksel olarak da anlamlı (p=0.000) bulundu.

İnhalasyon anestezikleri uygulamaya girdikleri günden beri karaciğer ve böbrek gibi parenkimli organlarda toksisiteye neden olmuşlardır. Bu nedenle bir kısmı kullanımdan kalkmıştır ^2,4,5,7. Karaciğer halotanın metabolize edildiği organ olması nedeniyle bu anestezik ajanın toksisitesinden en fazla etkilenen organ niteliğindedir. Volatil anestezikler karaciğere olumsuz etkilerini hem fonksiyonel hem de hücresel yapıyı bozarak gösterirler ^4,22. Halotan sağladığı fiyat avantajı sayesinde son 40 yılda en çok kullanılan volatil anestezik olma özelliğine sahip olurken, hepatotoksik etkisinden dolayı kullanımı gittikçe sınırlanmıştır ^23,24,25.

Organofosfatların detoksifikasyonunda primer görev alan PON 1 sentezinin ve salınmasının karaciğerden olması karaciğerin disfonksiyonuyla değişebilmektedir ^{10,11,12,15, 26}. Yüksek dansiteli lipoproteinlerle de sıkı bağı bulunan PON 1’in bu özelliği çok sayıdaki çalışmada ortaya konulmuştur ^{10,16,17,18,27}. Bilinen özellikleri içinde en önemlisi karaciğerde yoğun olarak bulunduğudur ^12,15. Rolünün doğal antioksidan olarak gözükmesi oksidasyon olayındaki durumuyla değerlendirilmeye çalışılmıştır. Öyle ki, PON1 yüksek dansiteli lipoproteinlerin yapısında bulunarak düşük dansiteli lipoproteinlere bağlı olan lipid peroksidasyon ürünlerinin oluşumunu ve dolayısıyla sitotoksisiteyi önleyebilmektedir. Halotanın oksidatif metabolizmasıyla ortaya çıkan ürünlerin antioksidanlarla azaltılabildiği bilinmektedir ¹². Ferre ve ark ²⁸ hepatik antioksidan PON1’in aktivitesi, lipid peroksidasyonu ve karaciğer hasarı arasındaki ilişkiyi incelemek amacıyla ratlarda CCl ₍₄₎ ile siroz modeli oluşturulmuştur. Bu çalışmada kontrol grubuna göre çalışma grubunda PON1 düzeyi daha düşük bulunmuştur. Lipid peroksidasyonu ve PON 1 aktivitesi arasındaki ilişki, bu enzimin karaciğer mikrozomlarında antioksidan sistemde önemli rol oynadığını göstermiştir. Ferre ve ark’nın yapmış olduğu başka bir çalışmada ²⁹ serum PON1 aktivitesinin karaciğer hasarının belirlenmesinde önemli bir gösterge olduğu belirtilmiştir. Bu çalışmada kronik karaciğer hastalığında PON 1 aktivitesi düşük bulunurken, hasar düzeyi artmış bulunmuştur.

Çalışmamızın sonucunda PON 1 enzimi 2 saatlik halotan uygulamalarından sonra (birinci, ikinci ve üçüncü halotan uygulamaları) anlamlı şekilde düşmüştür. Ancak, her uygulama sonrasındaki iki günlük dinlenme sonucu standart koşullarda saklanan ratlarda PON 1 düzeyi tekrar artma eğilimine girmiştir. Son uygulama olan üçüncü uygulamadan bir hafta sonra yapılan değerlendirmede PON 1 düzeyinin arttığı görülmüştür. Tüm uygulamaların sonrasında alınan karaciğer örneklerinden elde edilen histopatolojik değişmelerin her uygulama sonrasında arttığı tespit edilmiştir. Dinlenme dönemlerinde histopatolojik değişmelerin biraz düştüğünü göstermiştir. Histopatolojik hasar ve PON 1 düzeyi arasında akut dönem ve geç dönemlerinde görülen bu ilişki dikkat çekici olarak bulunmuştur. Histopatolojik hasar ve MDA düzeyleri arasındaki ilişki paralel bir gidişat gösterirken, dönemsel olarak PON1 düzeyi ile ters bir gidişat göstermiştir. PON1 düzeylerinin düştüğü dönemlerde hasarlanmanın yanısıra MDA düzeylerinin de artmış olduğu anlaşılmıştır.

Literatürde halotan hepatotoksisitesi ve serum PON 1 ilişkisini değerlendiren herhangi bir çalışmanın olmadığı görülmüştür. Bu nedenle halotan ile oluşan akut karaciğer hasarının belirlenmesinde ucuz, basit, kolay, hızlı ve önemli bir gösterge olması nedeniyle serum PON1 aktivitesi kullanılabilir bir parametre olarak değerlendirilmiştir. Bu konuda başka çalışmaların yapılmasına gereksinim vardır.

Teşekkür:Bu çalışma Münferit Çalışma Projesi olarak FÜBAP Proje No: 844 ile desteklenmiş olup, bu destekleri nedeniyle teşekkür ederiz.