Dokularda iskemi kritik bir zaman dilimini aşarsa; ardışık birtakım kimyasal olaylar oluşmakta ve bu olaylar hücre disfonksiyonu, interstisyel ödem, hücresel hasar ve en sonunda hücre ölümüne yol açmaktadır¹. İskemi hasarının giderilmesi için, bu kritik zaman diliminde dokunun tekrar oksijenize olması şarttır². Retina, iskemi ve sonrasındaki reperfüzyon peryoduna son derece duyarlıdır. Her iki duruma bağlı olarak hücre hasarı ve ölümü kaçınılmazdır. Genel olarak reperfüzyon inflamatuar mediatörlerin sentezini, oksijen kaynaklı serbest radikalleri, lipid mediatörlerini ve kan kaynaklı hücrelerin aktivasyonunu indüklemektedir³.

Rekombinant İL-11'in biyolojik aktivitesi proinflamatuar sitokinlerden Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α), İnterlökin-1β (İL-1β) ve nitrik oksit (NO) sentezini inhibe etmesi, hücre proliferasyonu ve diferansiyasyonunu stimüle etmesi ve bağ dokuyu koruyucu etkisi sonucu görülmektedir⁴.

Daha önceki çalışmalarda iskemi-reperfüzyon hasarının önlenmesi amacıyla bir çok ajan kullanılmıştır. Çalışmamızda, deneysel olarak oluşturduğumuz retinal iskemi-reperfüzyon hasarında, E. Coli'den rekombinant DNA teknolojisiyle üretilen rhIL-11'in retina dokusu üzerindeki koruyucu etkisini araştırdık.

Ortalama ağırlığı 500 gram olan 15 adet albino kobay çalışmaya alındı. Çalışma süresince denekler, çalışmanın yapıldığı kuruma ait Deneysel Araştırma Merkezi'nde uygun besleme şartlarında ve özel kafeslerde tutuldu ve Etik Kurul izni ile hayvanların bir gözü kullanılarak çalışma gerçekleştirildi. Kobaylar, her bir grupta 5 denek olacak şekilde randomize üç gruba ayrıldı. Her gruba standart hazırlık, anestezi ve cerrahi teknik uygulandı.

1. Grup (Plasebo grubu): Bu gruptaki kobaylara çalışma süresince sadece günlük 0,1 cc salin solüsyonu intraperitoneal verildi, iki gün sonra hayvanlar dekapite edildi ve her iki göz enüklee edildi (n=5).

2. Grup (Sham grubu): Kobaylara her iki gözde 90 dakika basınçla indüklenen iskemi peryodundan 1 saat önce ve 2 günlük reperfüzyon süreci boyunca 0,1 cc salin solüsyonu intraperitoneal olarak verildi, iki gün sonra hayvanlar dekapite edildi ve her iki göz enüklee edildi (n=5).

3. Grup (rhİL-11 Grubu): Kobaylara her iki gözde 90 dakika basınçla indüklenen iskemi peryodundan 1 saat önce ve 2 günlük reperfüzyon süreci boyunca 5μg/kg Rekombinant İL-11 intraperitoneal olarak verildi, iki gün sonra hayvanlar dekapite edildi ve her iki göz enüklee edildi (n=5).

Anestezi Tekniği
Anestezi ve analjezi uygulamasında intramüsküler 50 mg/kg ketamin hidroklorür (Ketalar, Eczacıbaşı, Türkiye) ve 5 mg/kg ksilazin hidroklorid (Rompun, Bayer, Türkiye) kombinasyonu kullanıldı. İşlem öncesi deneklerin kornealarına % 0,5'lik proparakain hidroklorid damlatıldı, deneklere solunum ve kan basıncı desteği sağlanmadı.

İskemi-Reperfüzyon indüksiyonu ve Cerrahi Teknik
Bütün deneklerin iki gözü çalışma kapsamına alınmış olup, her bir gruptaki deneklerin bir gözü biyokimyasal inceleme için, diğer gözü ise histopatolojik inceleme için kullanıldı. Deneklerde retinal iskemi oluşturmak amacıyla, 1 litrelik salin solüsyonu şişesine ucunda insulin iğnesi olan serum seti takılıp bu insulin iğnesi ile temporal limbustan ön kamaraya girildi. Göz içi basıncı 150 mmHg olacak şekilde serum şişesi aniden 204 cm yüksekliğe çıkartılarak tespit edildi ve bu yükseklikte 90 dakika süreyle tutuldu. Doksan dakikalık basınçla indüklenmiş iskemi peryodu sonrası serum şişesi göz seviyesine indirilerek, göz içi basıncı normal seviyeye düşürüldü ve takiben iğne ön kamaradan çekildi. Doksan dakikalık iskemi peryodundan sonra denekler 2 gün reperfüzyon peryodunda bırakıldı. İkinci günün sonunda tüm deneklere intrakardiyak 50 mg/kg thiopental sodyum (Pentothal Sodium, Abbot, Türkiye) verilerek kobaylar sakrifiye edildi ve gözler enüklee edildi. Her grupta deneklerden enüklee edilen gözler histopatolojik işleme tabi tutulmuştur. Histopatolojik inceleme için alınan gözler, % 10'luk formaldehid içine hızla konularak patoloji laboratuvarına iletildi ve patoloji laboratuvarına gönderilen gözlerin hangi gruba ait olduğu belirtilmedi.

Histopatolojik Değerlendirme
Histopatolojik incelemeye alınan gözler % 10'luk formalin solüsyonunda tespit edildi. Tespit sonrası optik sinir ve kornea tepesinden sagital olarak bir bistüri yardımıyla tüm göz küresini içerecek şekilde ikiye bölünerek rutin doku takip işlemine tabi tutuldu. Daha sonra dokular parafin bloklara gömülüp 5 mikronluk kesitler alındı. Kesitler Hemotoksilen-Eosin boyası ile boyandı. Preparatlar Olympus Bx50 marka ışık mikroskobu ile randomize olarak incelendi. Histopatolojik incelemede tüm preparatlarda optik diskin nazal tarafında diskten 2 mm mesafedeki iç pleksiform tabaka kalınlığı oküler mikrometre yardımıyla ölçüldü. Retinal tabaka boyunca internal limitan membran ve iç pleksiform tabakalarda 10 büyük büyütme alanında PNL infiltrasyonu değerlendirilerek sayıldı, ortalama standart sapmaları hesaplandı ve 400X büyütmede fotoğrafları çekildi.

İstatistiksel Analiz
Çalışmanın istatistiksel analizi, SPSS for Windows (ver. 13.0) paket programı ile yapıldı. Her grubun kendi içindeki karşılaştırmalarında Mann-Whitney U testi kullanıldı. İstatistiksel değerlendirmede p<0.05 değeri anlamlı olarak kabul edildi.

Histopatolojik olarak incelediğimiz retina kesitlerinde iç pleksiform tabakanın kalınlığı, rhİL-11 grubunda hem plasebo hem de sham grubuna göre anlamlı olarak farklı bulunmamıştır (sırasıyla p=1.000, p=0.095). Ancak sham grubunda plasebo grubuna göre anlamlı olarak daha kalın ölçülmüştür (p=0.032) (Tablo 1) (Şekil 1).

Tablo 1: Bütün gruplardaki iç pleksiform tabaka kalınlıkları (mikrometre).

Resim 1: İç pleksiform tabaka kalınlığının gruplar arasında karşılaştırılması. Retinal kalınlık rhİL–11 grubunda sham grubu ve plasebo grubuna göre anlamlı farklı bulunmamıştır (p=1,00, p=0,095).

Retinanın iç tabakalarındaki (internal limitan membran ve iç pleksiform tabaka) PNL infiltrasyonu, sham grubunda plasebo grubuna (p=0.012) ve rhİL-11 grubuna göre anlamlı artmış bulunurken (p=0.032), rhİL-11 grubunda plasebo grubuna göre anlamlı fark bulunamadı (p=0.189) (Tablo 2) (Şekil 2).

Tablo 2: Bütün gruplardaki polimorfonükleer lökosit (PNL) infiltrasyonunun (adet olarak) değerleri.

Resim 2: PNL İnfiltrasyonunun gruplar arasında karşılaştırılması. PNL infiltrasyonu rhİL–11 grubunda sham grubuna göre anlamlı olarak düşük (p=0,032), plasebo grubu ile anlamlı fark bulunmadı (p=0,189).

Histopatolojik incelemeye alınan gözlerin 400X büyütmede çekilmiş fotoğrafları Şekil 3-5'de izlenmektedir.

Resim 3: Plasebo grubu kobay retinası sagital kesiti. Salim retina görünümü (400X).

Resim 4: Sham grubu kobay retinasında iç pleksiform tabakada (ok) PNL infiltrasyonu (400X).

Resim 5: rhİL–11 grubu kobay retinası sagital kesiti. PNL izlenmemektedir (400X).

Retinanın iskemik hasarında serbest radikallerin rol oynadığı yapılan çalısmalarla gösterilmiştir^3,5,6. Serbest radikaller; membran lipidlerini peroksidasyona uğratarak, hücrede proteinlerin, karbonhidratların, nükleik asit ve DNA'nın yapısını değiştirerek, kalsiyum dengesini bozarak, aspartat ve glutamat gibi uyarıcı aminoasitlerin salınımını uyararak doku hasarına yol açmaktadır^5,7. Yoneda ve arkadaşlarının yaptığı bir çalışmada, İL-1β'nın sıçan retinasında oluşturulan iskemi-reperfüzyon hasarında önemli rol oynadığı ve İL-1β reseptör antagonistleri ile iskemik hasarın engellendiği saptanmıştır⁸.

İskemiye maruz, bırakılan glial hücrelerin TNF-α sentezleyerek retinal gangliyon hücrelerinin ölümünü hızlandırdığı bilinmektedir. TNF-α da iskemik retina hasarında önemli rol oynayan NO sentezini uyarmaktadır⁶. Nitrik oksit; süperoksit ve peroksinitrit radikalleri ile etkileşime girerek lipid peroksidasyonu ile hücre membran yapısını bozar ve iskemik hasarı meydana getirmektedir⁹. Fazla miktarda NO üretimi retinal iskemi sonrası nöronal hasara neden olmaktadır¹⁰. Sonuç olarak, TNF-α nın retina gangliyon hücrelerinde apoptozisi indükleyen bir mesajcı olduğu düşünülmektedir⁶.

Transforming growth factor-beta (TGF-β)'nın İ-R hasarında koruyucu etki gösterdiği saptanmıştır¹¹. TGF-β kronik iltihabi olaylarda fibrozis gelişmesinden sorumlu tutulmaktadır¹². Furuyoshi ve arkadaşlarının yaptığı bir çalışmada glokomatöz optik disk başında reaktif ısı şok proteini olan αB-crystalin düzeylerinin artmış olduğunu bulmuşlardır¹³. TGF-β'nın nötralizan antikorlarının kullanımı ile αB-crystalin düzeylerinin azaldığı ve İ-R hasarından hücrelerin korunduğu gösterilmiştir¹⁴.

İskemi-reperfüzyon hasarında retinal İL-6 düzeyinin anlamlı ölçüde arttığı gösterilmiştir¹⁵. İL-6, İL-1β ve TNF-α salınımını artırırken TNF-α da pozitif feedback ile İL-6 üretimini artırmaktadır¹⁶. İskemi-reperfüzyon İL-6'nın hızlı salınımına neden olmaktadır¹⁷. İskemi-reperfüzyon hasarında İL-1β, TNF-α, İnterferon-γ (İFN-γ), TGF-β ve İL-6'nın seviyesinin arttığı ve iç retina tabakalarındaki dejenerasyona aracılık ettiği rapor edilmiştir¹⁸.

Moreland ve arkadaşları rhİL11'in proinflamatuar sitokinleri ve NO seviyelerini azalttığını bildirmişlerdir¹⁹. 178 aminoasitli 18 kDa ağırlığında pleitropik bir polipeptit olan rhİL-11'in TNF-α ve İL-1β ekspresyonunu azaltarak koruyucu etki gösterdiği bilinmektedir⁴. rhİL-11 inflamasyonu baskılayıcı etkisini İFNγ, TNF-α, İL-1β, İL-6 ve NO sentaz ekspresyonunu azaltarak yaptığı gösterilmiştir²⁰. Bir çalışmada rhİL-11'in Heat Shock Proteini 25'in ekspresyonunu artırarak intestinal epitelyal hasarlarda sitoprotektif etkisini oksidatif stresi azaltarak etki gösterdiği tespit edilmiştir²¹. rhİL-11'in sitokin düzeylerinin azaltmasının olası mekanizması; MHC Klas I ve II antijen sunucu hücreleri inhibe etmesi olabileceği öne sürülmüştür. Bir diğer olası mekanizma ise İFN-γ gen ekspresyonunun düzenlenmesi ve bu yolla inflamatuvar sitokinler olan TNF-α, İL-1β, İL-6 düzeylerinin baskılanmasıdır²². Başka bir yayında İL-11 düzeyinin artışıyla TGF-β seviyelerinin azaldığı gösterilmiştir. rh-İL-11'in birçok inflamatuar medyatör üzerine inhibitör etkili olduğu gösterilmiştir. Bu medyatörler TNF-α, İnterlökin-12, İnterlökin-1, TGF-β ve NO'i içermektedir. Ayrıca aktive T hücrelerinden İFN-γ ve İnterlökin-2 salınımını da inhibe etmektedir²³.

İskemi-reperfüzyonun retinada meydana getirdiği hasar retinanın kalınlığını değerlendirilerek ölçülmektedir²⁴. Hughes yaptığı çalışmada basınçla indüklenmiş iskemik retina hasarında iç retinal dolaşımın tamir mekanizmalarındaki yetersizlik nedeniyle iç retina tabakalarının (özellikle iç pleksiform tabaka) hasara daha duyarlı olduğunu bildirmiştir²⁵. İskemiye maruz bırakılan retinalar incelendiğinde ciddi ödem, vakuolize boşluklar ve lökosit infiltrasyonu daha çok retinanın iç tabakalarında izlenmiştir²⁶. Çalışmamızda retinal İ-R hasarının bir göstergesi olarak tüm gruplarda iç pleksiform tabakanın kalınlığını veya bir başka deyişle retinal ödemi değerlendirdik. Buna göre sham grubunda plasebo grubuna göre iç pleksiform tabakayı daha kalın ölçtük (p=0.003). Ancak rhİL-11 grubunda sham grubuna göre iç pleksiform tabakanın kalınlığında istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulamadık (p=0.08). Bu durumda rhİL-11'in retinal kalınlığı yani retinal ödemi azaltamadığını düşünmekteyiz. Bunun nedeni retinal ödemin azaltılabilmesi için gereken reperfüzyon ve tedavi süresinin yedi günden daha fazla olması olabilir²⁷.

Reperfüzyon peryodu boyunca retinal venlerde ve kapillerlerde önemli miktarlarda lökosit birikmektedir. Reperfüzyondan 12 saat sonra lökosit kümelenmesi maksimum değerine ulaşmaktadır. Reperfüzyon hasarında nötrofil lökositlerden salgılanan proteolitik enzimler, PAF ve araşidonik asit metabolitleri doku zedelenmesine yol açmaktadır. Vasküler endoteldeki adhezyon molekülleri bloke edilerek lökosit-endotel iletişimi bozulabilmekte ve iskemi sonrası retinal atrofi önlenebilmektedir²⁷. Çalışmamızda gruplar ışık mikroskobu ile histopatolojik olarak incelenmiş ve birbirleriyle karşılaştırılmıştır. Buna göre reperfüzyonun ikinci gününde retinal iç tabakalarda (iç limitan membran ve iç pleksiform tabakalar) rhİL-11 grubunda sham grubuna göre lökosit infiltrasyonunun daha az olduğu izlenmiştir (p=0.032). Tsujikawa ve arkadaşlarının ratlar üzerinde yaptığı çalışmada 60 dakika retinal iskemi sonrası reperfüzyon başlamadan beş dakika önce P selektin veya ICAM-1 monoklonal antikoru uygulanarak lökosit infiltrasyonu araştırılmış ve her iki antikorun uygulandığı grupta lökosit birikiminin engellendiği gözlenmiştir²⁸.

Sonuç olarak; rhİL-11'in iskemik retina hasarında retinanın iç tabakalarındaki PNL infiltrasyonunu önleyici etkisi iskemik retina hastalıklarında kullanılabilir bir ajan olduğunu düşündürmektedir.