Safen ven, çapının geniş olması, anatomik olarak uzun seyretmesi, manipülasyona uygunluğu, uzun süre canlılığını koruması ve çıkarılmasındaki kolaylık nedeniyle koroner bypass cerrahisinde internal torasik arter ile birlikte en çok kullanılan grefttir¹.

Koroner bypass cerrahisinde greft olarak kullanılan safen venlerin postoperatif ilk birkaç ay içinde %13-14’lük bölümünün tıkandığı², birinci yılda ise safen ven duvarının intimasında ve düz kas hücrelerinde proliferasyonun başladığı görülmüştür³. Takip eden yıllarda ise intimal hiperplazinin arttığı ve yıl başına % 2 greft tıkanmasına yol açtığı tespit edilmiştir². By-pass sonrası safen ven greftinin tıkanmasının değişik nedenleri olmakla birlikte hazırlama sırasında yüksek basınçla şişirmenin safen ven greftinde endotel ve medya hasarına yol açtığı⁴, böylece endotelde oluşan hasarın erken dönemde trombüs, geç dönemde ise lipid birikimine yol açarak greft tıkanmasına sebep olduğu tespit edilmiştir⁶.

Safen ven greftinde oluşan endotel hasarının patogenezi halen tartışılmaya devam edilmektedir. Son zamanlarda endotel hasar oluşumunda apopitozisin de rolü olabileceği ileri sürülmektedir. Apopitozis, damar duvarının hücresel kompozisyonunun kontrolünde önemli bir role sahiptir ve hücre yapısını düzenleyen programlanmış hücre ölümü olarak da tanımlanabilir.

Hazırlama sırasında oluşan yapısal değişikliklerin vazodilatör özellikte farmakolojik ajanlar içeren değişik solüsyonlarda bekletilip belirli bir basınçta şişirilmesiyle giderilebileceği gösterilmiştir⁶. Ancak oluşan endotel hasarında apopitosisin rolü ve kullanılan hazırlama solüsyonlarının bu olayı engellemede etkin olup olmadıkları yeterince araştırılmamıştır.

Bu çalışmamızda verapamil, nitrogliserin ve papaverin ilave edilmiş hazırlama solüsyonlarıyla oluşturulan mekanik distansiyonun safen vendeki apopitotik aktivite üzerine etkisini araştırmayı amaçladık.

Çalışmamız, Fırat Üniversitesi Tıp Fakültesi Etik Kurul onayı alındıktan sonra, Fırat Üniversitesi Tıp Fakültesi Kalp ve Damar Cerrahisi ve Patoloji Anabilim Dalları tarafından gerçekleştirildi. Yapılacak çalışma hastalara anlatılarak Helsinki Deklarasyonu prensiplerine uygun olarak yapıldı. Çalışma, Fırat Üniversitesi Bilimsel Araştırma Proje Merkezi tarafından desteklendi.

Çalışmaya her iki cinsten, koroner arter bypass greft operasyonu geçirecek varis ve venöz yetmezlik tanısı almamış, sağlıklı vena safena magna (VSM)’ya sahip 32 hasta alındı. Hastalar 8’erli 4 gruba ayrıldı.

Gruplar:
Grup 1 (Kontrol grubu): Safen veni heparinli serum fizyolojik solüsyonu (300 cc %0.9 NaCl içine 5000 Ü heparin konularak hazırlanan solüsyon) ile 100 mmHg basınçla 2 dakika süre ile şişirildi, ardından bir saat süre ile aynı solüsyonda bekletildi..

Grup 2 (Papaverin grubu): Safen veni papaverinli serum fizyolojik solüsyonu (300 cc %0.9 NaCl heparinli serum fizyolojik solüsyonu içine 20 mg papaverin -Papaverin amp 40mg/2ml- konularak hazırlanan solüsyon) ile100 mmHg basınçla 2 dakika süre ile şişirildi, ardından bir saat süre ile aynı solüsyonda bekletildi.

Grup 3 (Verapamil grubu): Safen veni Verapamilli serum fizyolojik solüsyonu (300 cc %0.9 NaCl heparinli serum fizyolojik içine 5 mg verapamil - İsoptin amp 5mg/2ml- konularak hazırlanan solüsyon) ile 100 mg basınçla 2 dakika süre ile şişirildi, ardından bir saat süre ile aynı solüsyonda bekletildi.

Grup 4 (Nitrogliserin grubu): Safen veni nitrogliserinli serum fizyolojik solüsyonu (300 cc %0.9 NaCl heparinli serum fizyolojik solüsyonu içine 2.5 mg nitrogliserin (Perlinganit amp 10mg/10ml) konularak hazırlanan solüsyon) ile100 mmHg basınçla 2 dakika süre ile şişirildi, ardından bir saat süre ile aynı solüsyonda bekletildi.

Damar Örneklerinin Alınması-Hazırlanması:
Koroner bypass operasyonu için aynı cerrahi ekip tarafından hazırlanan VSM greftlerinden 5’er cm’lik safen ven parçalarının distal uçları bağlanıp proksimal uçları kanüle edildi. Safen venler hazırlanan solüsyonlarla üçlü musluğun bir ucundan 20 cc’lik enjektörle ortalama 100 mmHg basınçta şişirildi. Bu işlem üçlü musluğun diğer ucundan yerleştirilen transdüser aracılığıyla monitörize edildi (Resim 1). Mütakiben her bir vena safena magnadan yaklaşık 2 cm doku örneği alındı. Alınan doku örnekleri %10’luk formaldehitte tespit edildikten sonra parafin bloklara gömüldü.

Resim 1: Safen venin 100mmHg basınçla şişirilmesi

Histomorfolojik İnceleme:
Histomorfolojik ve immunohistokimyasal incelemelerin hepsi aynı patolog tarafından yapıldı. Hazırlanan parafin bloklardan mikrotom ile 4 μm kalınlığında kesitler alındı. Alınan kesitler deparafinize edilerek cam slaytlara monte edilip hematoksilen-eozin, Verhoeff’un Elastik boyası ve Masson Trichrome kollajen boyası ile boyandı. Işık mikroskobisinde ven duvar katmanlarının yapısal düzeni ve hücre dizilimleriyle birlikte kollajen ve elastin içerikteki patolojik değişiklikler değerlendirildi.

İmmunohistokimyasal İnceleme:
Hazırlanan parafin bloklardan elde edilen 4μm kalınlığındaki kesitlere avidin-biotin-peroksidaz yöntemi ile immunohistokimyasal olarak bax, bcl-2 ve kaspaz-9 uygulandı. Kesitler bax, bcl-2 için deparafinize ve rehidrate edildikten sonra endojen peroksidaz aktivitesini bloke etmek maksadıyla 5 dk. %3 hidrojen peroksitte tutuldu. Daha sonra distile su ile yıkanıp pH 6’da 650 mw (mikrodalga)’da sitrat buffer’da 5 dakika bekletildi. Kesitlere 10 dk Ultra V blok uygulandı. Kaspaz-9 için deparafinize ve rehidrate edildikten sonra 10 dakika pepsin enzimi uygulandı ve distile su ile yıkanıp 5 dk. %3 hidrojen peroksitte tutuldu. Daha sonra benmaride 37°C nemli ortamda 30 dk süreyle mouse monoclonal antibody Bax (Neomakers, Fremont, CA, USA), mouse monoclonal antibody Bcl- 2 (Neomakers, Fremont, CA, USA), rabbit polyclonal antibody Kaspaz-9 (Neomakers, Fremont,CA,USA) antikorları uygulandı. Ardından 0,001 M, pH 7.4 olan PBS ile yıkanarak avidin- biotin peroksidaz ile inkübe edildi. AEC kromojen ile boyandı. Bütün kesitlere Mayer Hematoksileni ile zıt boyama yapıldı ve özel kapatma maddesi (Ultra Mount Medium) ile kapatıldı.

İmmünohistokimyasal inceleme Enrico Ascher ve arkadaşlarının⁷ yöntemine göre yapıldı. Işık mikroskobisinde (Olympus model U-MDOB, Japan) × 400 büyütmede her kesitten rastgele 10 saha incelendi. Her sahadaki 100 hücreden bax (+), bcl-2 (+) ve kaspaz-9 (+) olanlar sayıldı. Toplam boyanan hücrelerin ortalama yüzdeleri alındı.

İstatiksel Analiz:
İstatistiksel değerlendirmeler için Statistical Programme Software System (SPSS) 15.0 programı kullanıldı. Elde edilen veriler ortalama ± standart deviasyon olarak gösterildi. Gruplar arası farkın değerlendirilmesinde, “tek yönlü varyans analizi (one-way ANOVA)” ve Post Hoc test olarakta “Tukey HSD (honestly significant difference) test” kullanıldı. p<0.05 olan değerler anlamlı olarak kabul edildi.

Histomorfolojik Veriler
Kontrol ve papaverin grubunda ışık mikroskop incelemelerinde endotel düzensizliği, yer yer endotel kopmaları, yağlı hücreler ve intimada hiperplazik alanların bulunduğu vasküler yapı bozulması gözlendi (Resim 2A-2B). Verapamil ve nitrogliserin solüsyonlarıyla hazırlanan safen vende ise birbirine benzer görünümlerin olduğu tunika intima, tunika medya ve adventisyanın doğal olarak izlendiği, minimal düzeyde endotel hücrelerinde kaybın olduğu görüldü (Resim 3).

Resim 2A: Kontrol grubunda (Grup 1) yer alan ve heparinli serum fizyolojikle şişirilmiş safen ven (HEx200)

Resim 2B: Papaverin grubunda (grup 2) yer alan ve heparinli serum fizyolojikle şişirilmiş safen ven (HEx200)

Resim 3: Nitrogliserin grubunda (Grup 4) yer alan ve heparinli serum fizyolojikle şişirilmiş safen ven (HEx200)

Sonuç olarak verapamil ve nitrogliserin solüsyonlar ile hazırlanan safen vende vasküler yapının minimal hasar da olsa korunduğu, ancak kontrol ve papaverin solüsyonlar ile hazırlanan safen vende ise tüm tabakalarda yapısal bozukluklar olduğu ve aterosklerotik zemine doğru gidişin hızlı olduğu gözlendi.

İmmunohistokimyasal Veriler
Bax Boyanması:
Gruplardan elde edilen örneklerin bax ile pozitif boyanan hücreler ve ortalama hücre yüzdeleri Tablo 1 ve Grafik 1'de gösterilmiştir. Bax boyanan ortalama hücre, kontrol ve papaverin grubunda anlamlı olarak yüksek bulunurken (p<0,005), nitrogliserin ve verapamil grubunda ise çok daha az bulundu (Tablo 1). Sonuç olarak kontrol ve papaverin grubunda, nitrogliserin ve verapamil grubuna kıyasla çok daha fazla bax pozitif boyanan hücre tespit edildi ve anlamlı bulundu.

Tablo 1: Safen ven gruplarında sayılan hücrelerin yüzde oranları

Bcl - 2 Boyanması:
Nitrogliserin ve verapamil grubundaki ven örneklerinde bcl-2 ile boyanan hücrelerin ortalamaları, kontrol ve papaverin grubuna oranla daha fazla pozitif boyanmış ve anlamlı (p<0,005) bulunmuştur (Tablo 1 ve Grafik 1).

Şekil 1: Bax (+) , Kaspaz (+) ve Bcl-2 (+) Hücrelerin Ortalama Yüzdeleri

Kaspaz - 9 Boyanması:
Her dört grubun ven örneklerinin incelenmesinde hem kaspaz-9 (+) boyanan hücre sayısı hem de ortalama hücre yüzdelerinin fazla ve birbirine yakın sayısal sonuçlar olduğu görüldü. (Tablo 1 ve Grafik 1). Her dört grup arasında kaspaz immünreaktivitesi açısından anlamlı farklılık gösterilemedi.

Koroner bypass cerrahisinde, safen ven grefti hazırlanma aşamasında oluşan spazmın giderilmesi için heparinli serum fizyolojik solusyonla mekanik distansiyon uygulanmaktadır. Safen ven hazırlanması sırasında basınçlı şişirme ve germenin safen vende endotel harabiyetine ve apoptozise neden olacağı gösterilmiştir⁸.

Ven greftin erken dönem hasarlanmasındaki apoptotik süreçte, medial düz kas hücrelerinde önemli hasar oluşur. Bu hasarın temelinde ven greftin mediasında bulunan düz kas hücreleri, fibroblastlar ve inflamatuar hücreler önemli rol oynar⁹. Mekanik distansiyon, inflamasyon ve medial iskeminin fibrozise neden olduğu ve bu medial düz kas hücre yapılanmasının apopitozis ile birlikte olduğu tespit edilmiştir¹⁰. Yapılan literatür çalışmalarında safen ven hazırlanması sırasında basınçlı şişirme ve germenin safen vende endotel harabiyetine ve apopitozise neden olacağı gösterilmiştir⁹.

Galea ve ark.¹¹, insan safen veninin 350 mmHg basınçla 2 dakika süreyle şişirilmesi sonrası ortaya çıkan değişimleri değerlendirdikleri çalışmalarında ven duvarında apopitozis ve erken uyarılara karşı bir transkriptör faktör olan c-fos m-RNA protein düzeylerinin arttığını, hücre proliferasyonunun ise azaldığını tespit etmişlerdir. Yapılan bir diğer çalışmada da insan safen ven grefti hazırlanması sırasında basınçla şişirme işleminin ven greftinin düz kas hücrelerinde bir mitojen-aktivatör protein kinaz olan p38 aktivasyonunu arttırdığı ve beraberinde apopitozis geliştiği, bunun da safen ven yetmezliği oluşumuna katkıda bulunduğu tespit edilmiştir¹². Şişirme basıncın 100 mmHg üzerinde tutulduğu uygulamalarda önemli derecede endotel hasarı oluştuğu, 100 mmHg altındaki uygulamalarda ise hasarın daha az olduğu belirlenmiştir¹³. Biz de bu çalışmamızda mekanik distansiyon basıncını, bu çalışmanın verileri doğrultusunda ortalama 100 mmHg dolayında tuttuk.

Jarzembowski ve ark.¹⁴, safen venin implantasyon öncesi bekletildiği solüsyonun endotelial ve düz kas hücrelerinde apopitozise yol açtığını göstermişlerdir. Heparinli kan ve heparinli serum fizyolojik solüsyonda bekletilen venlerle yapılan çalışmada, kanda bekletilen venlerde serum fizyolojik gruba göre daha çok duvar kasılması ve endotel hücre kaybının meydana geldiği, serum fizyolojik grupta ise damar gevşemesinin daha iyi olduğu tespit edilmiştir¹⁵. Bu nedenle çalışmamızda grupları oluştururken serum fizyolojik solüsyonu tercih ettik¹⁶. Hazırlama sırasında ortaya çıkan spazmı çözebilmek için çeşitli vazodilatatör ilaçlar kullanılmaktadır. Biz de ajanların en sık kullanılanlarından nitrogliserin, verapamil ve papaverin ile değişik hazırlama solüsyon grupları oluşturduk.

Apopitozis ile ilgili çalışmalarda, özellikle vasküler hücrelerin yaşama yeteneğinin moleküler düzeyde proapopitotik ve antiapopitotik sinyaller arasındaki denge ile belirlendiği gösterilmiştir. Bu olaylar bir takım gen familyaları aracılığı iledir ve bunlardan en önemlisi bcl-2 familyasıdır. Bcl-2 familyası üyelerinden bcl-2 ve bcl-XL hücrelerin hayatta kalmalarını sağlar ve apopitozisi önlerken, bax ve kaspazın proapopitotik özelliklerinden dolayı hücrede apopitozisi ilerlettiği tespit edilmiştir¹⁷. Bizim çalışmamızda da serum fizyolojik, papaverin, verapamil ve nitrogliserin solüsyonları ile mekanik distansiyon uygulanan safen venlerde immunohistokimyasal olarak proapopitotik bax ve kaspaz, antiapopitotik bcl boyanan hücre yüzdeleri belirlendi. Serum fizyolojik ve papaverin gruplarında bax (+) boyanan hücreler en yüksek oranda iken (sırasıyla % 85.00 ve % 64.25), verapamil ve nitrogliserin gruplarda ise bu değerler yaklaşık 3 kat daha az (sırasıyla % 23.75 ve %22.00) bulunmuştur. Verapamil ve nitrogliserin grubunda elde edilen değerler kliğimizce daha önce gerçekleştirilmiş bir çalışmada normal safen venlerde elde edilen bax pozitif boyanan hücre yüzdelerine (%22,13 ± 3,58) çok yakındı¹⁸. Bcl-2 (+) boyanan hücre yüzdeleri ise serum fizyolojik ve papaverin grubunda düşük iken (sırasıyla % 2.5 ve % 2.75) verapamil ve nitrogliserin grubunda yine yaklaşık 3 kat yüksek (sırasıyla % 7.25 ile % 8.88) saptanmıştır. Çalışmamızda serum fizyolojik içerisine papaverin ilavesinin bir koruma sağlamadığı ve apopitozisi indüklediği gösterilmiştir.

Baumann ve ark.¹⁹, nonspesifik güçlü vazodilatör olan papaverin ile hazırlanan solüsyonla damar duvarında yeterli relaksasyonun sağlandığını göstermişlerdir. Ancak Ruobos ve ark.²⁰, verapamil ve nitrogliserinin, serum fizyolojik ve papaverine göre daha az endotel ve media hasarı oluşturduğunu kanıtlamışlardır. Roberts ve ark.²¹ da papaverinle hazırlanan insan safen ven greftinde prostosiklinin azaldığı ve ciddi endotel hasarı oluştuğunu göstermişlerdir. Papaverinin pH 3-4 olacak şekilde asidik ortam oluşturduğu ve bu asidik ortamın endotelde hasar meydana getirdiği düşünülmektedir. Domuz koroner endotel hücreleri ve rat aortik düz kas hücreleriyle yapılan bir in vitro çalışmada, papaverin ile 1 saatlik inkubasyon sonrası hem düz kas hücreleri ve hem de endotelyal hücrelerinde TUNEL metoduyla boyanmış apoptotik hücre sayılarında belirgin artış gösterilmiştir²². Karabulut ve ark.¹³, serum fizyolojik içerisine nitrogliserin ve verapamil eklenmesiyle safen vende intima ve media hasarının minimal olduğunu göstermiştir. He ve ark.⁶, yaptıkları çalışmada nitrogliserin ve verepamil ile insan safen veninde maksimuma yakın relaksasyon sağladıklarını, bu etkilerin hızlı ve uzun süreli olduğunu bildirmişlerdir.

Sonuç olarak safen ven hazırlanması sırasında kullanılan verapamil ve nitrogliserin solüsyonlarının hem endotel harabiyetini, hem de programlanmış hücre ölümü olarak tanımlanan apopitozis aktivitesini azalttığı gösterilmiştir. Ancak tüm bunların yanında yaş, çevresel özellikler, hormonal ve genetik faktörlerin ven duvarı üzerindeki etkilerini göz ardı etmemek gerekir. Bu nedenle daha ileri çalışmalara ihtiyaç vardır.