Metotreksat, 2,4-diamino-N10-methyl propylglutamic acid, çok sayıda hematolojik rahatsızlıkların, romatoid artrit gibi otoimmün hastalıkların tedavisinde yaygın bir şekilde kullanılan kemoterapötik ajanlardan biridir. Ayrıca meme kanseri, akut lenfoblastik lösemi (ALL), osteojenik sarkom, akciğer kanseri ve mesane kanserinin tedavilerinde de kullanılmaktadır¹. Hücre bölünmesini inhibe etmesi nedeni ile kanser tedavisinde uzun zamandan beri kullanılan ilacın, santral sinir sistemi hariç, oral ve intravenöz uygulamalarında, doku dağılımı iyidir². Kanser tedavisinde kemoterapötik ajan olarak kullanımının dışında psöriasis, multiple skleroz gibi hastalıkların tedavisinde de kullanılmaktadır¹.

Metotreksatın hem tedavideki etkinliği hem de toksik etkileri hastadan hastaya değişkenlik gösterebilir³. Bu yüzden diğer antineoplastik ilaçlardan farklı olarak metotreksat geniş bir doz aralığında kullanılmaktadır. Akut lenfoblastik lösemi idame tedavisinde ve romatoid artrit, psöriazis gibi hastalıkların tedavisinde haftada 20 mg/m2 dozda kullanılırken, onkolojik hastalıklarda 1000-33000 mg/m2 gibi yüksek dozlarda uygulanmaktadır⁴.

Metotreksat, sentez fazındaki hücreleri etkileyip hücre replikasyonunda anahtar enzim olan dihidrofolat redüktaza bağlanarak pürin ve primidin yapımı için gerekli tetrahidrofolat sentezini inhibe eder⁵. Metotreksat, dihidrofolat redüktaz enzimini inhibe ederek DNA, RNA ve ATP sentezi için gerekli olan tetrahidrofolat sentezini durdurur, sonuçta timidilat, pürin nükleotidleri ve aminoasitlerin sentezinde azalmaya neden olur. Böylece nükleik asid ve protein sentezini önler⁶.

Akut metotreksat toksisitesinde; metotreksat enjeksiyonunu takiben 2-4 saat içinde başağrısı, ense sertliği, bulantı, kusma ve ateş ortaya çıkar. Bazen bacaklara yayılan bel ağrısı, takiben duyu kaybı, parapleji, barsak veya mesane disfonksiyonu ile beyin ve spinal kordda demiyelinizasyon oluşabilir. Tranvers myelopati intratekal metotreksat tedavisinin nadir komplikasyonu olup genellikle birkaç enjeksiyondan sonra ortaya çıkar⁷. Metotreksat pürin ve pirimidin sentezini inhibe ederek apoptozisle sonuçlanan DNA defektlerine yol açabilir⁸. Metotreksat tedavisi alan romatoid artritli hastaların karaciğer biyopsisinde, hem folat eksikliği hem de metotreksat poliglutamatlarının birikimi gösterilmiştir⁹.

Biz bu çalışmada klinikte yaygın bir kullanım alanına sahip olan metotreksatın karaciğer üzerine olan etkilerini belirlemeyi amaçladık.

Deneysel çalışmaya Fırat Üniversitesi Hayvan Deneyleri Etik Kurulu’ndan onay alındıktan sonra başlandı. Çalışmamızda 18 adet ergin Wistar Albino cinsi dişi sıçan kullanıldı. Sıçanlar 22ºC oda ısısında 12 saat ışık (7:00–19:00) ve 12 saat karanlıkta (19:00–7:00) özel olarak yaptırılan ve her gün altları temizlenen kafeslerde beslendi. Yemler; çelik kaplarda, su; cam biberonlarda (normal çeşme suyu) verildi.

Anabilim dalımızda daha önce yapılan bir çalışmada literatür taramaları sonucu tayin edilen 20mg/kg tek doz metotreksatın denekleri fizyolojik anlamda zorladığı gözlendi. Bu çalışma protokolüne göre 20 mg/kg metotreksatın 2. dozunun deneklerin yaşamlarını tehdit edebileceği öngörüsüyle dozun 15mg/kg olarak uygulanmasının daha uygun olacağı düşünüldü.

Denekler her biri 6 sıçan içeren 3 gruba ayrıldı.

I. Grup: Kontrol (n: 6)

II. Grup: Deneyin 1. gününde 15 mg/kg intraperitoneal (i.p) metotreksat uygulanan sıçanlardan oluşturuldu (n: 6).

III. Grup: Deneyin 1. ve 5. gününde 15 mg/kg i.p metotreksat uygulanan sıçanlardan oluşturuldu (n: 6).

Deneyin 8. gününde tüm gruplardaki sıçanlar 75mg/kg ketamin + 10mg/kg xylazine i.p uygulanarak oluşturulan anestezi altında dekapite edildi. Dekapitasyonun ardından midsaggital insizyon yapılarak sıçanların karaciğer dokuları hızlıca çıkarılıp %10’luk formaldehit ile tespit edildi. Rutin histolojik doku hazırlama prosedürü ile parafin bloklar hazırlandı. Parafin bloklardan 5µm kalınlığında kesitler alındı ve kesitlere Hematoksilen & Eozin (H&E) ve Periodic acid Schiff (PAS) boyama teknikleri uygulandı. Hazırlanan preperatlar Olympus BH2 fotomikroskop ile incelenip fotoğraflandı.

Kontrol grubuna ait kesitlerde hepatositler, sinüzoidler ve sinüzoidal hücreler, portal alan ve hepatositlerin glikojen içerikleri normal olarak gözlendi (Şekil 1). Tek doz metotreksat uygulanan grup II’de vasküler konjesyon, sinüzoidal dilatasyon, periportal alanda mononükleer hücre infiltrasyonu ve az sayıda heterokromatik çekirdekli hepatositlere rastlandı. Grup II’de ayrıca hepatositlerin glikojen içeriğinde kontrol grubu ile karşılaştırıldığında azalma olduğu gözlendi (Şekil 2-4). Grup III’te metotreksatın tekrarlayan dozunun karaciğerdeki yapısal değişiklikleri şiddetlendirdiği ayırt edildi. Bu grupta vasküler konjesyonun ve sinüzoidal dilatasyonun oldukça yaygın olduğu saptandı (Şekil 5). Belirgin periportal inflamasyon, makroveziküler yağlanma ve hepatositlerin glikojen içeriğinde tükenme gözlendi (Şekil 6-8). Ayrıca çok sayıda heterokromatik çekirdekli hepatosit ve özellikle portal alanlarda fibroblast aktivasyonu saptandı (Şekil 9, 10).

Şekil 1: Grup I. Hepatositler, sinuzoidler (*), portal alan (ok) ve hepatositlerin glikojen içeriği (ok başı) normal olarak ayırt edilmekte. PAS x 400

Şekil 2: Grup II. Sinüzoidal dilatasyon ve konjesyon (*). H&E x 400

Şekil 3: Grup II. Periportal mononükleer hücre infiltrasyonu (ok). H&E x 200.

Şekil 4: Grup II. Heterekromatik çekirdekli hepatositler (ok) ve metotreksat uygulamasına bağlı olarak az sayıda glikojen içeren hepatositler (ok başı). PAS x 200.

Şekil 5: Grup III. Belirgin sinüzoidal dilatasyon (ok) ve vasküler konjesyon (*). H&E x 200.

Şekil 6: Grup III. Periportal mononükleer hücre infiltrasyonu (ok) ve vasküler konjesyon (*). H&E x 200.

Şekil 7: Grup III. Periportal alanda yer alan hepatositlerde belirgin makroveziküler yağlanma (ok) ve vasküler konjesyon (*). H&E x 400.

Şekil 8: Grup III. Periportal alanda yer alan hepatositlerin glikojen içeriğinin boşaldığı ve hepatositlerdeki makroveziküler yağlanma (ok) ayırt edilmekte. PAS x 400.

Şekil 9: Grup III. Periportal alanda yer alan çok sayıdaki heterokromatik (ok) ve piknotik (ok başı) çekirdekli hepatositler ve hepatositlerdeki makroveziküler yağlanma. H&E x 200.

Şekil 10: Grup III. Portal alanda belirgin fibroblast aktivasyonu (ok) ve vasküler konjesyon. H&E x 200.

Metotreksat, antikanserojen, antiinflamatuar, antimetabolit etkili bir ilaç olup lösemi, lenfoma, osteosarkom, baş ve boyun tümörleri, akciğer ve meme kanserlerinin yanısıra psöriasis, dermatomiyozit, sarkoidoz ve romatoid artrit gibi bazı inflamatuvar hastalıkların tedavisinde de yaygın bir şekilde kullanılmaktadır¹⁰. Klinikte geniş kullanım alanları olmasıyla birlikte, karaciğer üzerine olan toksik etkisinden dolayı da dikkat çekmektedir⁸. Kronik düşük doz metotreksat kullanımı, fibrozis ve siroza neden olurken yüksek doz metotreksat, karaciğer fonksiyon testlerinde ani bozulmalara neden olmaktadır¹¹.

Metotreksatın neden olduğu hepatotoksisitenin mekanizması tam olarak bilinmemekle birlikte toksisiteyi açıklayacak birkaç mekanizma öne sürülmüştür. Metotreksat temel metaboliti olan 7-hidroksimetotreksat’a karaciğerde dönüşmekte ve karaciğer hücrelerinde poliglutamat formunda depolanmaktadır. Uzun süre metotreksat tedavisinde, poliglutamat formunun birikmi ve folat seviyesinin azalması hepatotoksisitenin sebeplerindendir¹⁰.

Yine metotreksat, sitozolik NADPDH (nikotinamid adenin fosfatdehidrojenaz) ve NADP bağımlı malik enzimi inhibe ederek hücre içi NADPH’ın azalmasına neden olmaktadır. NADPH, sitozolik antioksidan olan indirgenmiş glutatyon (GSH)’nun devamlılığını sağlayan glutatyon reduktaz (GSSG-R) enzimi için gerekmektedir. Metotreksat tedavisi nedeniyle GSH seviyesinin azalması, reaktif oksijen radikallerine karşı hücreleri koruyan antioksidan savunma sisteminin etkinliğinin azalması ile sonuçlanmaktadır¹⁰. Metotreksat kullanımına bağlı olarak azalan NADPH seviyeleri, hepatositleri reaktif oksijen radikallerine karşı koruyan redükte glutatyon seviyelerinin düşmesine, bu da hepatosit hasarına neden olmaktadır⁸.

Bir çalışmada metotreksat verilen sıçanların kan, karaciğer, böbrek ve ince barsak dokularında GSH seviyelerinin azaldığı, inflamatuvar yanıtın göstergesi olan myeloperoksidaz aktivitesinin ve lipid peroksidasyonunun göstergesi olan malondialdehid (MDA) seviyelerinin ise arttığı rapor edilmektedir¹². Bu durum steatozis (vücutta aşırı yağ toplanması), kolestazis (safra akımının kesilmesi), fibrozis ve sonuç olarak siroz gibi karaciğer hasarı yanında böbrek hasarı, kemik iliği supresyonu, mukozit, pulmoner fibrozis gibi ciddi yan etkilerin de sebebi olabilmektedir¹⁰. Kronik metotreksat kullanımında karaciğerde histolojik olarak, yağ infiltrasyonu, inflamasyon, hücresel nekroz ve bunların sonucunda da fibrozis gelişebileceği gibi klinik ve biyokimyasal bulgular yıllarca görülmeyebilir⁸. Yapılan bir başka çalışmada, romatoid artritli hastaların metotreksat ile tedavisi sonunda karaciğer enzimlerinde geçici yükselme, 4 yıllık tedavinin sonunda ortadan şiddetliye değişen derecede fibrozis oluştuğu rapor edilmektedir¹³.

İlaçların metabolizmasından sorumlu temel organ olan karaciğerin metotreksat uygulamasından etkilendiği tavşanlar üzerinde yapılan bir başka çalışmada da saptanmıştır. Sekiz hafta süresince 0.25 mg/kg /gün intra musküler metotreksat enjeksiyonu yapılan tavşanların karaciğer SGOT, SGPT, ALP ve bilirubin düzeylerinin ve MDA’nın anlamlı derecede yükseldiği, total serum proteinin ise azaldığı gözlenmiştir¹⁴.

Dalaklıoğlu ve ark.¹⁵ yaptıkları çalışmada üç gün 7mg/kg/gün dozda uyguladıkları metotreksatın serum AST, ALT, ALP düzeylerini anlamlı derecede artırdığını rapor etmişlerdir. Tedavi grubunda kullanılan resveratrolün ise oksidatif stresi inhibe ederek karaciğerde koruyucu etki gösterdiğini vurgulamışlardır.

Biz yaptığımız bu çalışmada metotreksat uygulamasına bağlı olarak hepatositlerdeki glikojen depolarında azalma, sinuzoidlerde dilatasyon, vasküler konjesyon ve özellikle portal alanlarda daha yaygın olmakla birlikte mononükleer çekirdekli hücre infiltrasyonu gözlemledik. Metotreksatın özellikle tekrarlayan uygulamasından sonra ayrıca çok sayıda piknotik çekirdekli hepatosit, makroveziküler yağlanma ve hiperkromatik çekirdekli hepatositler ayırtedildi. Bir başka göze çarpan bulgumuz ise, yer yer fibroblast aktivasyonunun gözlenmesi idi. Piknotik ve hiperkromatik çekirdekli hepatositlerin sıkça gözlenmesi metotreksatın DNA hasarına, mononükleer çekirdekli hücre infiltrasyonları ise inflamasyona yol açtığını işaret etmektedir. Yine belirgin sıklıkta fibroblast aktivasyonu, metotreksat kullanımının uzun vadede fibrozise neden olabileceğini göstermektedir.

Sonuç olarak bu çalışmada, kliniklerde bir çok hastalığın tedavisinde kullanılan metotreksatın doz ve süre ayarlamasının çok iyi yapılması gerektiği belirlenmiştir. Aksi halde metotreksat uygulaması karaciğerde yapısal ve fizyolojik anlamda ciddi bozukluklar meydana getirebilir.