Kimyasallar
Deneysel preklinik çalışmamızda Dosetaksel (R&D Systems, ABD), EF24 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ABD), Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 besiyeri, L-Glutamin, fötal sığır serumu (FBS), penisilin-streptomisin ve dimetil sülfoksit (DMSO) (Gibco, Grand Island, NY, ABD), Cytotoxicity Detection Kit Plus, High Pure RNA Isolation Kit, Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit ve LightCycler® 480 Probes Master (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Almanya) ve CycleTEST Plus DNA Reagent Kit ile FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I (Becton Dickinson, ABD) satın alınmıştır. Kullanılan diğer kimyasallar Sigma-Aldrich’ten (St. Louis, MO, ABD) sağlanmıştır.
Taksan grubu antineoplastik bir ajan olan dosetaksel, β-tübülin alt ünitelerine yüksek afinite ile bağlanarak, mitozun metafaz aşamasında mikrotübüllerin depolimerizasyonunu engelleyerek etkisini gösterir 18-20. Dosetaksel, metastatik meme kanserinde tek başına da kullanılabilen aktif maddelerden biri olma özelliğindedir. Dosetaksel ile yapılan çalışmalarda meme kanserinde % 50-68 oranında başarı sağlanmış olmasına rağmen, dosetaksel'in meme kanserindeki optimum dozu henüz saptanamamıştır. Hem in vitro, hem de in vivo çalışmalarda, hücre içine alımının hızlı olmasına bağlı olarak dosetakselin birçok hücre grubunda antineoplastik aktivite gösterdiği görülmüştür 20,21. Öte yandan güncel çalışmalar, meme kanseri tedavisinde altın standart olan taksanların farklı antineoplastik ajanlarla yapılan kombinasyonlarının, MDR-1 ve Pgp aracılı dışa atım mekanizmaları başta olmak üzere direnç mekanizmalarını uyardığı ve sağ kalıma aracılık eden gen ve proteinlerin transkripsiyon ve translasyonlarını artırarak apoptotik cevabın oluşmasını engellediği gösterilmiştir 22-25. Bu nedenle özellikle metastatik ve erken evre meme kanseri olgularında etkinliği kanıtlanmış olan taksanlar ile kombine edilerek kemo-duyarlılığı artıracak yeni ajanlara ihtiyaç duyulmaktadır 26-28.
Sentetik kurkumin analoğu olan difenil difloroketon (EF24) molekülü ovaryum, kolon, prostat, meme, pankreas, mezotelyoma ve akciğer kanseri gibi farklı kanser hücre hatlarına tek başına ve/veya diğer kanser karşıtı ajanlar ile birlikte uygulandığı zaman kanser karşıtı aktiviteyi potansiyelize ettiği gösterilmiştir 29-37.
Bu bilgiler doğrultusunda çalışmamızda taksan grubu antineoplastik b ajan olan dosetaksel bileşiği ile EF24’ün farklı konsantrasyonlarda tek başlarına veya sıralı uygulanmalarının, MCF-7 meme kanseri hücre hattında hücre canlılığı, sitotoksisite, apoptoz ve proliferasyon üzerindeki olası etki ve/veya etkilerinin araştırılması amaçlanmıştır.
Hücre Kültürü
Hücre kültürü çalışmalarında, MCF-7 (ATCC® No: HTB-22™-Human breast cancer) insan meme kanseri hücreleri kullanılmıştır. Hücreler standart kültür koşullarında ve %10 FBS, 2 μM L-glutamin ve 100U/ml penisilin/streptomisin içeren RPMI-1640 besiyeri içerisinde 37 °C sıcaklıkta ve %5 CO2 içeren inkübatörde (Hanau, Almanya) kültüre edilmiştir. Hücre kültür kabının %70-80’ini kapladığında %0.025 tripsin-EDTA çözeltisi ile kültür kaplarından pasaj veya ekim yapmak üzere ayrılması sağlanmıştır. Yeterli sayıya ulaşan hücreler, 96’lık kültür kaplarına, her bir kuyucukta 4x104 hücre olacak şekilde ekilmiştir. Çalışmada hiç bir ajan (EF24 ve dosetaksel) verilmeyen MCF-7 hücreleri kontrol grubu olarak kullanılmıştır. Buna ilaveten çalışmada çözücü kontrolü olarak % 0.1 DMSO kullanılmıştır. Hücreler, kademeli olarak Dosetaksel (0.1-50 μM) ve EF24 (0.25-50 μM) doz aralığında, tek tek ve/veya sıralı olarak birlikte 24 ve/veya 48 saat inkübe edilmiştir.
Dosetaksel ve EF24 Konsantrasyonlarının Hazırlanması
Dosetaksel ve EF24, %0.1'lik DMSO’da çözdürülerek stok solüsyon hazırlanmış ve bu stok solüsyonlar deney süresince -20 °C’de muhafaza edilmiştir. Dosetaksel (0.1-50 μM) ve EF24’ün (0.25-50 μM) değişen konsantrasyonları deneyde kullanılmak üzere, kullanımlarından hemen önce kültür besiyerinde seyreltilerek hazırlanmıştır. Deneyler birbirinden bağımsız 3 tekrar ve her grupta 6 örnek olacak şekilde çalışılmıştır.
Hücre Canlılığı Analizi
Dosetaksel ve EF24’ün tek başlarına ve sıralı uygulamanın hücre canlılığı üzerine olan etkilerinin değerlendirilmesi amacıyla MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolyum bromür) yöntemi kullanılmıştır 38,39. Kısaca, 96’lık kültür kaplarına, her bir kuyucukta 4x104 olacak şekilde ekilerek bir gece inkübasyona bırakılmıştır. Ardından, hücrelere artan dozlarda Dosetaksel ve EF24 tek tek ve/veya sıralı bir şekilde uygulanmıştır. Dosetaksel ve EF24’ün farklı konsantrasyonlarının uygulandığı kuyucukların inkübasyon süreleri sonunda, kuyucuklardaki 100 μl taze besiyeri ile değiştirilerek her bir kuyucuğa MTT çalışma solüsyonundan 10 μl/kuyucuk (5 mg/ml) olacak şekilde ilave edilmiştir. 4 saat 37 °C ve %5 CO2 içeren ortamda inkübasyon sonunda oluşan formazan kristalleri 100 μl DMSO ile çözülmüştür. Çözünen kristallerin absorbans değerleri 570 nm dalga boyunda ELISA mikroplaka okuyucuda (Spectramax M3 plate reader, Molecular Devices, Silicon Valley, California, ABD) okutulmuştur. Kontrol gruplarının absorbans değerlerinin ortalaması alınarak, bu değer %100 canlı hücre olarak kabul edilmiştir. Dosetaksel ve/veya EF24 uygulanan kuyucuklardan elde edilen absorbans değerleri, kontrol absorbans değerine oranlanarak, yüzde canlılık olarak belirlenmiş ve her ilaç için IC50 değeri hesaplanmıştır. Her deney 3 tekrarlı olarak çalışılmıştır.
Besiyerine Salınan Laktat Dehidrojenaz (LDH) Tayini
MCF-7 hücrelerinde EF24 ve dosetaksel’in etkilerine bakılmak üzere apoptotik/nekrotik hücrelerin geç fazında görülen plazma membran bütünlüğünün bozulması sonucunda besiyerine salınan LDH miktarının ölçülmesi amacıyla Cytotoxicity Detection kit plus (LDH) kiti kullanılarak aşağıdaki protokole göre ölçülmüştür 39. MCF-7 hücreleri 96’lık kültür kaplarına her bir kuyucuğa 4x104 hücre gelecek şekilde ekilmiştir. Dosetaksel ve/veya EF24’ün belirlenen dozlarının inkübasyon süreleri dolduktan sonra kültür ortamından 100 μl besiyeri alınıp 96’lık kültür kaplarına aktarılmıştır. Kuyulara kit içerisinde bulunan 100 μl taze hazırlanmış reaksiyon karışımı eklenerek, ışıktan uzak bir ortamda, oda sıcaklığında 30 dk bekletilmiş ve ardından mikroplaka okuyucu cihazı ile 490 nm dalga boyundaki absorbans değerleri okunmuştur. Deney protokolünde kullanılan kontroller: Kör kontrol: Besiyeri, Düşük kontrol: Besiyeri+Hücre, Yüksek kontrol: Triton X-100 solüsyonu+Besiyeri+Hücre. Elde edilen absorbans değerlerinden kör kontrolün absorbansı çıkartıldıktan sonra, ilaçların sitotoksisite değerinin yüzdesi aşağıdaki formül kullanılarak hesaplanmıştır.
Sitotoksisite (%) = (örnek abs. – düşük kontrol abs. / yüksek kontrol abs. – düşük kontrol abs.) x 100
Hücre Ölümü Analizi
Hücre ölümünü test etmek amacıyla “FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I” (katalog no:556547) kullanılmıştır. Buna göre, hücreler PBS ile yıkandıktan sonra 100 μl 1x tampon çözelti içinde çözülmüştür. 1x105 hücre için 5 μl Annexin V ve 5 μl PI eklenmiş ve 15 dk. karanlıkta oda sıcaklığında bekletilmiştir. Yıkamadan 300 μl tampon çözelti eklenmiş ve akım sitometri (Beckton Dickinson, FACS Canto) cihazında analiz edilmiştir.
RNA İzolasyonu ve Revers Transkriptaz PCR (RT-PCR) Yöntemi
MCF-7 hücre hattından High Pure RNA Isolation Kiti (Roche, Almanya) kullanılarak RNA izolasyonu yapılmıştır. Elde edilen RNA’ların miktarları ve saflıkları spektrofotometrik olarak NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific, İngiltere) (260/280 nm) cihazında ölçülerek RT-PCR’da kullanılana kadar -80 °C derin dondurucuda saklanmıştır. Hedef genlere ait mRNA ifade düzeylerinin belirlenmesi amacıyla, hücre hattından elde edilmiş RNA örneklerinden 1 μg total RNA, Random hekzamer primerleri ve cDNA sentez kiti (Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit, Roche, Almanya) kullanılarak komplementer DNA (cDNA) sentezi gerçekleştirilmiştir.
Kantitatif Real Time PCR Yöntemi
Gen ifade düzeyi çalışmaları kantitatif Real-time PCR (qRT-PCR) yöntemi ile Light Cycler-480TM (Roche, Almanya) cihazı kullanılarak belirlenmiştir. Amplifikasyonlar 10 μl toplam tepkime hacmi içerisinde, cDNA, bölgeye özgü primerler, UPL probu ve LC Probe Master mix kullanılarak gerçekleştirilmiştir, cMYC ve cFOS gen ifadelerini normalize etmek için, gliseraldehit-3-fosfat dehidrogenaz (GAPDH) geni referans olarak alınmış ve tüm cDNA örnekleri her bir gen için üçer tekrarlı çalışılmıştır. Seçilen genler ile ilgili özgün primer ve UPL prob listesi tablo 1’de verilmiştir. Reaksiyonda, 95 ºC'de 10 dakikalık denatürasyon, 50 ºC'de 10 saniye primer bağlanması ve 72 ºC'de 10 saniyelik zincir uzaması basamaklarını oluşturacak şekilde 45 döngüden oluşan PCR tepkimesi uygulanmıştır. Hedef genlerin ifade düzeyleri GAPDH housekeping geni referans alınarak REST 2009 (Relative expression software tool) yazılımı (Qiagen, Almanya) kullanılarak hesaplanmıştır.
İstatistiksel Analiz Yöntemleri
Hücre canlılığı, LDH salınması, hücre döngüsü analiz sonuçları ve apoptotik/nekrotik hücre oranlarının istatistiksel açıdan değerlendirilmesi bağımsız Student's t-testi ile SigmaStat v3.5 programı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Tüm sonuçlar ortalama ± standart hata olarak verilerek, p<0.05, p<0.01 ve p<0.001 olan değerler istatistiksel olarak anlamlı kabul edilmiştir. cMYC ve cFOS mRNA ifade düzeylerindeki farklılıklar “Pair-wise Fixed Reallocation Randomization” istatistiksel analiz testi kullanılarak “REST (2009 V2.0.13)” programı ile karşılaştırılmıştır 40.