Üreme hücrelerinin bulunduğu görüntü isleme gerçekleştirilecek görüntüler Konya Selçuklu Hastanesindeki Olympus CX41RF ışık mikroskobundan HP 945 dijital kamera yardımıyla alınan görüntülerdir.
Örnekler, bir yıl boyunca düzenli cinsel ilişkide bulunmalarına rağmen çocuk sahibi olamayan infertilite nedeni ile müracaat eden hastalardan seçilmiş ve ejakulat mastürbasyonla toplanmıştır. Toplanan bu örneklerde hastalar, sperm toplanmasından en az 48 saat en fazla 7 gün cinsel perhizde bulunmuşlardır.
Görüntüler uygulamanın süresini kısaltmak amacıyla normal boyutunun 1/5’i oranında küçültülerek 400x300 piksel boyutlarında 24 bit 96 dpi RGB formatında kullanılmıştır.
Çalışmada gri seviye görüntü isleme algoritmaları kullanıldığı için görüntülerin gri tona çevrilmesi gerekmektedir. Elde edilen görüntülerin 8 bit gri tona çevrilmesi için ITU standart gri ton hesaplama formülü 13 kullanılmıştır. Bu formüle göre pikselin gri değeri;
şeklinde hesaplanmaktadır.
Görüntünün kamera hataları, elektron mikroskobu ile kamera bağlantısından oluşabilecek hatalar ve ışık hataları gibi hatalardan arınması ve uygulama tarafından islenebilir hale gelmesi için 3x3 çekirdek boyutlu Median Noise Reduction 13,14 filtresi 2 kez ard arda uygulanmıştır. Filtrenin ardı ardına kullanılması daha iyi yumuşatma için elverişli bir yöntemdir.
Median filtresi uygulanmış görüntüye üreme hücrelerinin baş kısımlarının ayrık olarak görüntülenebilmesi ve bölütlenmesi için Eşik Değer (Threshold) 15 filtresi uygulanmıştır. Görüntüye uygulanan eşik değer filtresinde eşik değeri 128 olarak alınmıştır. Bu durumda ortaya çıkan yeni görüntü binary (siyah-beyaz) bir görünüm şeklindedir.
Eşik değer filtresi uygulanan görüntü için bölütlenmiş hücrelerin seçilmesi ve etiketlenmesi aşamasında geliştirdiğimiz yeni algoritma kullanılmıştır. Bu algoritmaya göre; görüntü üzerinde 3x3 boyutunda bir tarama operatör çalışmaktadır. Tarama operatörü görüntüyü tararken operatörün üzerinde çalıştığı 3x3’lük toplam 9 pikselden beyaz piksel sayısı yarıdan fazla (>3x3/2=4.5) ya da başka bir deyişle 5 ve daha üstü beyaz piksele sahip olan bir konuma ulaştığında olası hücre varlığı araştırması için bulunduğu konumdan itibaren 2x2 boyutunda yeni bir operatör çalışmaktadır. Bu 2x2’lik operatör ise etiketleme operatörüdür. Çalışan etiketleme operatörü üreme hücresini baş kısmını temsil eden beyaz alanı taramakta ve mevcut beyaz alanları etiketlemektedir. Etiketleme operatörü çalıştığı konumdan itibaren görüntüyü tararken 2x2’lik toplam 4 pikselden beyaz piksel sayısı yarıya eşit ya da daha fazla (>= 2x2/2=2) başka bir deyişle 2 ve daha üstü beyaz piksele sahip bir konumda ise bu beyaz pikseller etiketlenmektedir.
Etiketlenme işleminde ise iki durum bulunmaktadır. Eğer bu operatörün üzerinde bulunduğu etiketlenecek olan beyaz piksellerden daha önce etiketlenmiş olanı varsa etiketlenmemiş pikseller de daha önceden etiketlenen bu komşularının devamı olarak aynı numara ile etiketlenmektedirler. Eğer beyaz piksellerden daha önce etiketlenmiş olanı yoksa yeni bir etiket numarası ile etiketlenmektedirler.
2x2’lik etiketleme operatörünün beyaz pikselleri etiketlediği her durumda operatör 2 ya da daha fazla sayıda beyaz piksel bulduğu sürece bir piksel yukarıda, bir piksel aşağıda, bir piksel solda ve bir piksel sağda olmak üzere tekrar çalışmaktadır. Bu yeni çalıştığı her 4 konumda da aynı şart sağlandığı sürece etiketleme sürekli olarak devam etmektedir.
Özetlemek gerekirse; tarama operatörü görüntüyü enine ve boyuna tararken, olası hücre varlığını araştırmakta, mevcut bir durum için etiketleme operatörünü çalıştırmaktadır. Etiketleme operatörü ise geçerli şartlara sahip pikselleri etiketleyerek hücre piksel dizisini oluşturmaktadır.
Bu operatörler Şekil 1’de bir örnek üzerinde gösterilmiştir. Hücreleri oluşturan piksellerin konumları hücre piksel dizisinde bulunmaktadır. Bu hücre-piksel dizisi kullanılarak hücrelerin yoğunlukları ve merkezleri belirlenmiştir. Hücrenin yoğunluğu için toplam piksel sayısı, merkezi için ise toplam değerlerin ortalaması kullanılmıştır. Kullanılan algoritmanın akış diyagramı Şekil 2’de gösterildiği gibidir. Her temel adım sonucu oluşan görüntüler ise Şekil 3’de gösterilmiştir.
Büyütmek İçin Tıklayın |
Şekil 1: a) 3x3 boyutundaki hücre tarama operatörü, b) 2x2 boyutundaki hücre etiketleme operatörü, c) yeni piksellerin hücreye dahil edilmesi |
Büyütmek İçin Tıklayın |
Şekil 3: a) Görüntünün elektron mikroskobundan alınan orijinal hali (sol-üst) b) görüntünün grileştirilmiş hali (sağ-üst), c) gri seviye görüntüye eşik değer işlemi uygulanması sonucu oluşan siyah-beyaz görüntü, d) hücre sayımı ve bölütlemenin ardından sonra oluşan görüntü. |
Kruger’in tanımladığı kriterlere göre normal sperm morfolojisinde baş kısmın avoid ve 2–3µ eninde ve 4-5µ boyunda olduğu görülmektedir. Burada ortalama olarak elips alan formülüne göre baş boyutları alanı yaklaşık 6.28 µ2 ile 11.78 µ2 arasındadır.
Elektron mikroskobu sperm hücre görüntülerini 1x100 ölçekle büyütmüş, kamera ise 8 kez analog 7 kez dijital toplam 56 kez büyütmüştür. Ancak uygulama analiz süresinin kısalması açısından elde edilen görüntüler 400x300 piksel boyutlarına getirilmek için 5 kez küçültülmüştür. Buna göre görüntülenen hücrelerin normal morfolojiye sahip olmaları için Kruger’in kriterlerine göre büyüklükleri yaklaşık 7.88 mm2 ve 14.77 mm2 arasında olmalıdır.
Analizde kullanılan görüntülerin 72 dpi yoğunlukta çekildiği göz önüne alınınca 1 pikselin sahip olduğu alan yaklaşık olarak 0.1244 mm2 olarak hesaplanır.
Böylece görüntü içerisinde bulunan çeşitli piksel büyüklüklerine sahip hücrelerin Kruger’in kriterlerine göre normal morfolojiye sahip olmaları için toplam yoğunlukları yaklaşık olarak 63 (7.88/0.1244) piksel ve 119 (14.77/0.1244) piksel arasında olmalıdır.
Buna göre çalışmamızda 63 piksel ile 119 piksel değer aralığı dışındaki piksel yoğunluğuna sahip olan hücreleri, Kruger’in tanımladığı kriterlere göre normal morfolojide sahip olmaları gereken aralığın dışında oldukları için anomali olarak kabul ederek ihmal ettik.
)
)
)