Gereç ve Yöntem: Sıçanlara tek doz L-NNA (Grup aL-NNA, n=19, 25mg/kg i.p.) uygulandı; bu ana grup 3 alt gruba ayrılarak sırasıyla 1 (Grup aLNNA1, n=4), 3 (Grup aL-NNA3, n=9 ) ve 24 (Grup aL-NNA24, n=6) saat sonra sistolik kan basıncı (SKB) ve plazma NOx ölçümleri yapıldı. MDA ölçümleri ise 1. ve 24. saatlerde yapıldı. Bir diğer seri deneyde, sıçanlara iki hafta süreyle L-NNA içme suyunda iki farklı konsantrasyonda (sırasıyla, Grup dL-NNA, ≈15mg/100ml, n=19 ve Grup yL-NNA, ≈45mg/100ml, n=28) uygulandı. dL-NNA grubu 3 alt gruba ayrıldı: bir altgrupta L-NNA uygulamasının durdurulmasından hemen sonra (Grup dL-NNA0, n=7), diğerlerinde ise L-NNA uygulamasının durdurulmasından 24 (Grup dLNNA24, n=6) ve 48 (Grup dL-NNA48, n=6) saat sonra SKB, plazma NOx ve MDA düzeyleri ölçüldü. Grup yL-NNA ise altgruplara ayrılmadı.

Bulgular: aL-NNA grubunda SKB 1. ve 3. saatlerde yükselirken 24.saatte bazal değerlere geri döndü. Bu grupta plazma NOx değerleri 3. saatte düştü fakat 24. saatte normale döndü, plazma MDA değerleri ise 1. saatten itibaren anlamlı şekilde yükseldi. dL-NNA0 alt grubunda deney sonunda plazma NOx ve MDA düzeyleri değişmezken dL-NNA24 ve dL-NNA48 altguplarında MDA yükseldi. yL-NNA grubunda ise hem plazma NOx hem de MDA düzeyleri yüksekti.

Sonuç: Bu sonuçlar tek doz L-NNA uygulamasının oksidatif strese neden olduğunu, ancak kronik uygulamalarda oksidatif stresin sadece yüksek konsantrasyonlarda oluştuğunu göstermektedir. ©2008, Fırat Üniversitesi, Tıp Fakültesi

Bu çalışmada: sıçanlarda NOS inhibitörü L-NNA’ın akut ve kronik uygulamalarının, plazma NOx ve MDA düzeylerine etkilerinin araştırılması hedeflenmiştir.

Deneysel prosedür
Sıçanlar 4 gruba ayrıldı ve bu gruplardan akut ve düşük doz kronik L-NNA uygulanan gruplardan ilaç uygulaması sürecinde farklı zamanlarda yapılan ölçümler dikkate alınarak alt gruplar oluşturuldu. Birinci grup kontrol olarak değerlendirildi ve kontrol grubu sıçanlarda sadece SKB ölçüldü ve kan örnekleri alındı (Grup kontrol, n=10). İkinci grupta akut L-NNA uygulamasının etkilerini belirlemek için sıçanlara SKB ölçümlerini takiben tek doz L-NNA uygulandı (Grup aL-NNA, n=19, 25mg/kg i.p.); bu grup daha sonra 3 alt gruba ayrılarak sırasıyla 1 (Grup aL-NNA1, n=4), 3 (Grup aL-NNA3, n=9) ve 24 saat (Grup aL-NNA24, n=6) sonra tekrar SKB ölçümleri yapıldı. Sıçanlardan 1, 3 ve 24. saatlerde kan örnekleri alındı. Bu kan örnekleri ikiye ayrılarak 1, 3 ve 24. saatlerde plazma NOx ölçümleri yapıldı. Bir ve 24. saatlerde plazma MDA düzeyleri ölçüldü. Üçüncü saatte sıçanlardan yeterince kan örneği alınamadığından sadece NOx ölçülebildi, MDA ölçümleri ise yapılamadı. Düşük doz kronik L-NNA uygulamasının etkilerini belirlemek için üçüncü gruba L-NNA içme suyuyla ≈15mg/100ml (Grup dL-NNA, n=19) konsantrasyonda 2 hafta süreyle uygulandı. dL-NNA grubundaki sıçanların bir kısmı 2 hafta sonunda hemen (Grup dL-NNA0, n=7), diğerleri ise L-NNA uygulamasına son verildikten 24 (Grup dL-NNA24, n=6) ve 48 (Grup dLNNA48, n=6) saat sonra test edildiler. Yüksek doz kronik LNNA uygulamasının etkilerini belirlemek için de dördüncü gruba L-NNA içme suyuyla ≈45mg/100ml (Grup yL-NNA, n=28) 2 hafta süreyle uygulandı ve L-NNA uygulamasına son verildikten hemen sonra sıçanların SKB ölçüldü ve kan örnekleri alındı. Çalışmada esas olarak akut L-NNA uygulamasının etkilerinin incelenmesi amaçlandığı için yLNNA grubu altguplara ayrılmadı.

Kan basıncı ölçümleri
Bilinci açık sıçanların kan basıncı ölçümleri kuyruktan indirekt tail-cuff metodu ile yapıldı (MAY BPHR 9610-PC TAİL-CUFF İndirect Blood Pressure Recorder, Commat Ltd. Ankara, Türkiye).

Kan örneklerinin alınması
Kan basıncı ölçümlerinden hemen sonra bütün gruplardaki sıçanlar üretan ile (1.4 gr/kg, i.p.) anesteziye edilerek sol ventrikülden kan örnekleri alındı. Anestezi altında önce abdomen sonra toraks açılarak enjektör ile apeksten sol ventriküle girilerek kan alındı. Alınan kan örnekleri ETDA’lı tüplere konularak 5000 g de 10 dakika süreyle santrüfüjlendi. Plazmalar ayrılarak ölçüm yapılana kadar (–20ºC ) saklandı.

Plazma NOx ölçümleri
Plazma NOx ölçümleri Cortas’ın çalıştığı metoda göre yapıldı ⁸. Plazmalardan 250µl alınarak üzerlerine 1 ml çinko sülfat, 1,250 µl (55 mmol/lt) sodyum hidroksit çözeltisi ilave edilerek proteinler çöktürüldü. Daha sonra 3500g de 10 dakika boyunca santrüfüjlendi. Üstteki çözelti kısmı alınarak üzerine 2ml distile su 1 ml glisin tamponu eklenerek bakır kaplı kadmiyum granüllerinin üzerine eklendikten sonra 90 dakika boyunca karanlıkta inkübe edilerek ortamda bulunan nitrat, nitrite indirgendi. Numunelerden 2 ml alınarak üzerine 1 ml sülfanilamid 1 ml naftiletilendiamin çözeltisi 0.5 ml distile su ilave edildi ve 10 dakika bekletildikten sonra spektrofotometre ile 545 nm dalga boyunda ölçüm yapıldı. Numunelerin konsantrasyon değerleri, elde edilen absorbans değerlerinin kalibrasyon eğrisine yerleştirilmesiyle hesaplandı.

Plazma MDA ölçümleri
Plazma MDA ölçümleri Tsaknis ve ark. nın çalıştığı metoda göre yapıldı ⁹. Kısaca 0.25 ml plazma alınarak üzerine HclO₄ (0.25ml 0.5M) ilave edilerek proteinler çöktürüldükten sonra saf su ilave edilerek toplam hacim 1ml ye tamamlandı. Karışım 4500 devirde (rpm) 5 dakika santrüfüjlendi. Berrak kısımdan 20 µl alınarak HPLC de analiz edildi. Analizler hareketli faz olarak 0.5gr KH₂PO_4-metanol (%65-35; pH:4 ortamı asitlendirmek için %10’luk H₃PO₄ ilave edildi.) karışımında 254 nm de SGE marka Wakosill II 5C18RS 5 µm (150X4.6mm SS) kolonu kullanılarak akış hızı 1.5mL/dakikaya ayarlanarak yapıldı.

Kullanılan kimyasal maddeler
L-NNA, N-(-1-naphthyl)-etilendiamin dihidroklorid, glisin hidroklorid Sigma Aldrich Inc. den (St. Louis, MO. A.B.D.), perklorik asit, potasyum fosfat, metanol, fosforik asit, bakır sülfat pentahidrat, sodyum nitrit, sodyum hidroksit, sülfanilamid Merk KgaA dan (Darmstadt, Almanya), granül kadmiyum Fluka Chemie den (Steinheim, İsviçre), çinko sülfat heptahidrat Carlo Erba dan (Milano, İtalya) satın alındı.

İstatistik
Elde edilen veriler ortalama±standart hata olarak ‘Origin 5.0’ istatistik programı kullanılarak Student-t testi ile belirlendi. p<0.05 değerler istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

Büyütmek İçin Tıklayın

Tablo 1: Kontrol ve aL-NNA alt gruplarının SKB, plazma NOx ve plazma MDA düzeyleri

Yüksek doz kronik L-NNA uygulamasının SKB, plazma NOx ve MDA üzerine etkisi
Yüksek doz L-NNA uygulanan grubun SKB değerleri kontrol grubuyla karşılaştırıldığında anlamlı olarak yükselmiştir (mmHg; kontrol 127±1.9; yL-NNA 167.1±3.2). LNNA uygulamasının sonlandırılmasından sonra alınan plazma örneklerinde yapılan NOx ölçümlerinde NOx değerlerinin anlamlı olarak yükseldiği bulunmuştur (µmol/L; kontrol 29±0.1; yL-NNA 35±0.1). Plazma MDA değerlerinin de anlamlı olarak yükseldiği bulunmuştur (ppm; kontrol 1.6±0.1; yL-NNA 4.2±0.2). (Tablo 2).

Büyütmek İçin Tıklayın

Tablo 2: Kontrol ve yL-NNA gruplarının SKB. plazma NOx ve plazma MDA düzeyleri

Düşük doz kronik L-NNA uygulamasının SKB, plazma NOx ve MDA üzerine etkisi Düşük doz L-NNA uygulanan grubun SKB değerleri kontrol grubuyla karşılaştırıldığında anlamlı olarak yükselmiştir (mmHg; kontrol 127±1.9, dL-NNA 156.6±2.5). Plazma NOx değerleri ise L-NNA uygulaması sonunda değişmemiş, L-NNA uygulamasına son verildikten 24 saat anlamlı olarak düşmüş fakat 48 saat sonra normale dönmüştür (µmol/L; kontrol 29±0.1; dL-NNA0 28±0.1; dL-NNA24 24±0.1 ve dL-NNA48 26±0.1). Yine benzer şekilde düşük doz L-NNA uygulanan grupta plazma MDA düzeyi ile kontrol grubu karşılaştırıldığında anlamlı bir değişiklik gözlenmemiştir (ppm; kontrol 1.6±0.1; dL-NNA0 1.8±0.2). İlginç olarak düşük konsantrasyon L-NNA uygulamasına son verildikten 24 ve 48 saat sonra plazma MDA düzeylerinde artış tespit edilmiştir (ppm; kontrol 1.6±0.1; dL-NNA24 2.5±0.3; dL-NNA48 2.6±0.3), (Tablo 3).

Büyütmek İçin Tıklayın

Tablo 3: Kontrol ve dL-NNA grubunun SKB, plazma NOx ve plazma MDA düzeyleri

NOS inhibitörlerinin kronik uygulamalarıyla plazma NOx değişimi arasındaki ilişkiler farklılık göstermektedir. Uzun süreli NOS inhibitörü uygulandığında plazma NOx düzeylerinin azaldığı, arttığı veya değişmediği bildirilmiştir^7,10,14. Bu çalışma da, yüksek doz L-NNA uygulaması sonucu SKB’nın anlamlı olarak artmasına rağmen plazma NOx düzeylerinin de yükseldiği ve aynı süre fakat daha düşük doz L-NNA uygulandığında ise SKB nın arttığı ancak plazma NOx düzeylerinin değişmediği tespit edilmiştir. İlginç olarak düşük doz L-NNA uygulamasına son verildikten 24 saat sonra plazma NOx düzeyleri anlamlı olarak düşmüş ve fakat 48 saat sonra normale dönmüştür. Çelişkili sonuçlar iNOS’un muhtemel aktivasyonuyla ve/veya NOx eliminasyonuyla ilişkili olabilir¹⁰. Farklı çalışmalarda farklı NOS inhibitörlerinin uygulama süreleri ve özellikle kan örneklerinin alınma zamanı da önem arz edebilir.

Lipid peroksidasyonunun en iyi bilinen ürünü olan MDA’nın plazma düzeyi oksidatif stresin bir göstergesidir⁶. Tavşanlarda akciğer iskemi-reperfüzyon hasarı ve endotoksin indüklü akciğer hasarında, sıçanlarda akut nekrotik pankreatitte akut L-NNA uygulamaları sonucu oksidatif hasarın bir göstergesi olarak MDA düzeyinin yükseldiği bildirilmiştir^11-13. Yine hipoksik hasar olusturulan yenidoğan sıçanlarda LNNA’nın intestinal dokuda MDA düzeyini arttırdığı bildirilmiştir¹⁴. Öncekilerden farklı olarak bu çalışmada LNNA herhangi bir hasar oluşturulmamış sıçanlara uygulandı ve bu uygulamanın plazma MDA düzeyine etkileri incelendi. Çalışmada tek doz L-NNA uygulamasını takiben 1. saatte plazma MDA düzeyinin kontrol grubuna göre yüksek çıkması ve 24. saatte de bu yükselişini devam ettirmesi, akut L-NNA uygulamasının oksidatif hasara neden olduğunu düşündürmektedir. Kronik NOS inhibisyonu uygulamasında ise sıçanların plazma MDA düzeyinin arttığını belirten çalışmaların yanı sıra NOS inhibisyonu ile plazma MDA düzeyinin değişmediğini belirten çalışmalara da rastlanmaktadır^7,15. Akut uygulamalardakine benzer şekilde dimetilnitrozamin indüklü kronik hepatit olusturulan sıçanlara L-NNA uygulandığında karaciğer hasarının şiddetlendiği ve karaciğer MDA düzeyinin arttığı gösterilmiştir¹⁶. Bu çalışmada da, kronik L-NNA uygulamalarında, yüksek doz LNNA uygulaması sıçanların plazma MDA düzeylerini anlamlı olarak yükseltmiştir. Plazma MDA düzeylerindeki bu yükselme yine L-NNA’nın oksidatif hasara bağlı toksik etkisini göstermektedir. Husain’in 8 hafta boyunca 10mg/kg, s.c. LNAME uyguladığı sıçanların plazma MDA düzeylerinde anlamlı bir yükselme olması bu çalışma ile uyumluluk göstermektedir⁷. Ancak, daha düşük doz L-NNA uygulamasında ise plazma MDA düzeylerinde kontrol grubuna göre farklılık tespit edilmemiştir. İlginç olarak, bu sıçanlarda L-NNA uygulamasına son verildikten 24 ve 48 saat sonra plazma MDA düzeyleri anlamlı olarak yükselmiştir. Düşük doz L-NNA uygulamasında, oksidatif strese karsı bir adaptasyon gelişmesi ve fakat kronik L-NNA uygulamasına son verilmesinin de bizzat oksidatif strese yol açabileceği düşünülebilir.

Sonuç olarak, bu çalışma tek doz L-NNA uygulamasını takiben zamana bağlı olarak SKB, plazma NOx ve plazma MDA düzeylerinin ölçüldüğü ilk çalışmadır. Elde edilen bulgular akut L-NNA uygulamasının oksidatif strese yol açtığına işaret etmekte, kronik uygulamalarda ise yüksek doz L-NNA’nın oksidatif hasara bağlı olarak plazma MDA düzeyini arttırdığını fakat düşük doz L-NNA’nın MDA düzeyini değiştirmediğini göstermektedir.

1) Ellis G, Adatia I, Yazdanpanah M, Makela SK. Nitrite and nitrate analyses: a clinical biochemistry perspective. Clin Biochem 1998; 31 :195-220.

2) Marzinzig M, Nussler AK, Stadler J, et al.. Improved methods to measure end products of nitric oxide in biological fluids: nitrite, nitrate, and S-nitrosothiols. Nitric Oxide 1997; 1: 177-189.

3) Gardiner SM, Compton AM, Bennett T, Palmer RM, Moncada S. Control of regional blood flow by endothelium-derived nitric oxide. Hypertension 1990; 15: 486-492.

4) Nagata K, Iwasaki Y, Takemura Y, et al.. Effect of inhaled NGnitro- L-arginine methyl ester on Candida-induced acute lung injury. Chest 2003; 124: 2293-2301.

5) Zatz R, Baylis C. Chronic nitric oxide inhibition model six years on. Hypertension 1998; 32 :958-964.

6) Del Rio D, Stewart AJ, Pellegrini N. A review of recent studies on malondialdehyde as toxic molecule and biological marker of oxidative stress. Nutr Metab Cardiovasc Dis 2005; 15: 316-328.

7) Husain K. Interaction of exercise training and chronic NOS inhibition on blood pressure, heart rate, NO and antioxidants in plasma of rats. Pathophysiology 2003; 10: 47-56.

8) Cortas NK, Wakid NW. Determination of inorganic nitrate in serum and urine by a kinetic cadmium-reduction method. Clin Chem 1990; 36: 1440-1443.

9) Tsaknis J, Lalas S, Tychopoulos V, Hole M, Smith G. Rapid high-performance liquid chromatographic method of determining malondialdehyde for evaluation of rancidity in edible oils. The Analyst 1998; 123: 325-327.

10) Nava E, Lüscher TF. Hypertension in: Gabor M. Rubanyi (Editor) Pathophysiology and clinical application of nitric oxide. 1 Baskı, Amsterdam: Harwood Academic Publisher, 1999: 251-266

11) Liang GY, Niu YM, Liu DX, Xu G, Cai QY. The protective efficacy of rabbit endogenous nitric oxide against acute rabbit lung ischemia-reperfusion injury and its mechanism. Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban. 2005; 36: 246-248.

12) Wan M, Ling YL, Gu ZY, Zhang JL, Huang SS. Effects of endogenous nitric oxide on pulmonary artery hypertension and lung injury induced by endotoxin. Sheng Li Xue Bao. 1999; 51: 80-86.

13) Zhang Z, Sun J, Li F, Zhang S, Cui Y, Sun H, Liu S. Protective effect of nitric oxide on pancreas and its relation to sulfhydryl compounds and oxygen free radicals. Zhonghua Wai Ke Za Zhi. 2000; 38: 928-930.

14) Kilic I, Kilic BA, Güven C, Demirpence E, Aksit MA. Role of nitric oxide in hypoxia-induced changes in newborn rats. Biol Neonate 2000; 78: 191-197.

15) Yin QF, Fu SH, He P, Xiong Y. Dimethylarginine dimethylaminohydrolase inhibition and asymmetric dimethylarginine accumulation contribute to endothelial dysfunction in rats exposed to glycosylated protein: effects of aminoguanidine. Atherosclerosis 2007; 190: 53-61.

16) Lukivskaya O, Lis R, Zwierz K, Buko V. Effect of the nitric oxide donor and the nitric oxide synthase inhibitor on the liver of rats with chronic hepatitis induced by dimethylnitrosamine. Pol J Pharmacol 2004; 56: 599-604.