Gereç ve Yöntem: Çalışmaya fertil on kadın ve Tekrarlayan İmplantasyon Başarısızlığı (TİB) olan onyedi kadın dahil edildi, endometriyumlarından biyopsi örnekleri alındı. Endometrial örneklere monolayer ko-kültür tekniği uygulandı. Fertil ve TİB grubu bireylerin endometrial ko-kültüründe gland ve stromal hücreler invert mikroskopla değerlendirildi ve istatiksel analizi yapıldı.

Bulgular: Fertil ve TİB grubu kadınların endometrial ko-kültürleri mikroskobik olarak karşılaştırıldı. Gland ve stromal hücrelerin gelişimi açısından morfolojik farklar gözlendi. Fertil grupta endometrial ko-kültür hücrelerinin gelişimi TİB grubundan daha iyiydi. TİB grubu hücreler, daha az gelişmişti ve daha az sayıya sahipti. Kantitatif açıdan TİB grubu hücrelerinin gelişimi daha azdı. Fertil ve TİB grubunda gland ve stromal hücrelerin karşılaştırılması sonucunda istatistiksel açıdan anlamlı farklılık tesbit edildi.

Sonuç: Fertil ve TİB olan kadınların endometrial ko-kültürleri karşılaştırıldığında sadece morfolojik olarak değil ayrıca istatistiksel açıdan da anlamlı fark tesbit edilmiştir. Ancak, endometrial ko-kültür uygulamalarının, TİB hastalarında implantasyon oranlarını arttırdığı belirtilmektedir. O halde, implantasyonu ve embriyo gelişim kalitesini artıran moleküler mekanizmaların açıklanmasını sağlayacak yeni çalışmalara ihtiyaç vardır.

Steril koşullarda, pipelle (Endocell, France) alınan endometrial biyopsi örnekleri, Early’s Balanced Salt Solution (EBSS) veya %0.9 izotonik sodyum klorür içinde IVF laboratuvarına getirilerek işleme başlandı. Tüm işlemler laminal flow altında steril koşullarda gerçekleştirildi. Endometrial dokular birkaç kez EBSS ile kan ve mukusun uzaklaştırılması için yıkandı. Yıkama sonrası doku parçaları mekanik olarak makas ile yaklaşık 1-2mm3 lük küçük parçalara bölündü ve 15ml’lik santrifuj tüplerine (Falcon 2095) transfer edildi. Enzimatik ayrıştırma için, doku parçalarının üzerine 0,25mg/ml kollajenaz Tip II ilave edildi, otomatik pastör pipeti ile birkaç kez homojenize edilip 5 dk. oda ısısında bekletildi (gravite sedimantasyon) ve bu süre sonunda çöken doku parçalarının üzerindeki süpernatant çekilerek başka bir tüpe transfer edildi. Diğer tüpe transfer edilen supernatant 400g’de santrifüj edilerek, santrifuj sonrasında süpernatant atıldı ve dipteki hücre pelletinin üzerine L-Glutaminli RPMI 1640, 1% PSA (penisilin, streptomisin, amfoterisin) ve 10,1% denature maternal serum ilave edildi. İlk tüpte dibe çöken ve enzimatik yolla tamamiyle parçalanmamış olan doku parçalarının üzerine tekrar kollojenaz Tip II 0,25mg/ml konuldu ve 37°C’deki çalkalamalı su banyosunda 5 dk bekletildi. Aynı işlem birkaç kez daha tekrarlandı. Her seferinde supernatant tüpten alınarak 1500g’de 5 dk santrifüjlendi ve stromal hücrelerin isolasyonu sağlandı. Enzimatik yolla tamamen ayrıştırılamayan ve özellikle gland epitel hücresi içeren dokular ise kollajenaz Tip II ile muamele edildi. Bu işlemler sonunda stromal hücreler ve tüpün dibinde kalan ve kar tanelerine benzeyen gland hücre grupları için tüplerin üzeri etiketlendi. Gland hücre grubu olarak kalan hücre peleti, 25cm²’lik hücre kültür flaskına ekildi. Stromal hücreler için etiketlenen tüplerin içerikleri tek bir tüpte toplanarak 1500g’de 5dk santrifüjlendi ve doku kültür flasklarına aktarıldı. Ko-Kültür medyumlarının 3 günde bir, günlük olarak hazırlanmış olan yeni ko-kültür medyumu ile değiştirilmesi sağlandı.

İstatiksel Analiz
İstatistiksel analiz için SPSS 11.5 paket programı kullanıldı. Fertil ve TİB grubundaki gland epitel ve stromal hücreler arasında karşılaştırma yapılabilmesi için Independent-Samples T testi uygulandı.

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 1a, 1b: Fertil grup endometriyal doku ko-kültürlerinde gland ve stromal hücreler. Beyaz ok; gland hücresi. Siyah ok; stromal hücre.

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 2a, 2b: TİB grubu endometriyal doku ko-kültürlerinde gland ve stromal hücreler. Beyaz ok; gland hücresi. Siyah ok; stromal hücre.

Fertil ve TİB grubu gland epitel hücreleri değerlendirildiğinde istatistiksel açıdan farklı olduğu bulunmuştur (p=0.001). Fertil ve TİB grubu stromal hücreleri karşılaştırıldığında ise, yine istatistiksel açıdan anlamlı bir fark olduğu gözlenmiştir (p=0.001), (Tablo 1).

Büyütmek İçin Tıklayın

Tablo 1: Fertil ve TİB grubundaki kadınların endometrium doku ko-kültürlerinin gland ve stroma hücreleri açısından karşılaştırılması

Joo ve ark’ nın¹⁴ çalışmasında endometrial kokültür sisteminin embriyo gelişimini desteklemesinde, embriyo ve helper (destek) hücreleri arasındaki hücreden hücreye direkt temasın varlığının etkili olduğu ifade edilmiştir. Ayrıca medyumlardan geriye kalan toksik zararlı maddelerin ve reaktif oksijen türlerinin ko-kültür hücreleri tarafından elimine edildiği ve aynı hücrelerin besleyici maddeleri kültür ortamına salarak embriyo gelişimini olumlu etkilediği gösterilmiştir. Birçok araştırmacının ko-kültür uygulamalarıyla ilgili olarak olumlu sonuçlar elde ettikleri ortaya konulmuştur. Bununla birlikte, ko-kültürün etkinliğiyle ilgili karşıt görüşlerde vardır. Fabbri ve arkadaşları ko-kültüre alınan embriyoların uterusa transferinden sonra gebelik oranlarının gerçek artışıyla, sonuçların çelişebileceğini belirtmişlerdir¹⁵. Plachot ve ark.¹⁶ kokültür sonucunda, granülosa hücrelerinin embriyo gelişimini olumlu etkilemesine rağmen, TİB olan bireylerde gebelik oranlarında bir gelişme sağlamadığını vurgulamışlardır. 2008’de yapılan bir meta-analizin detaylarında, ko-kültür çalışmaları arasında tutarsızlıklar ortaya çıktığı tesbit edilmiştir. Ancak insan veya insandan farklı çeşitli hücre dizilerinin kullanılmış olması, hücre tipi spesifikliği gibi durumlardan dolayı randomize kontrollü çalışmalara ihtiyaç olduğu belirtilmiştir^17,18.

Bu çalışmada, fertil ve TİB olan kadınların endometrial ko-kültürleri incelendiğinde, fertil grup kokültürlerinde, gland epitel hücreleri ve stromal hücrelerin hem morfolojik hemde sayısal açıdan oldukça iyi gelişim gösterdikleri sonucuna varılmıştır. (Şekil 1a,1b). Bu durum fertil bireylerde endometriyumun implantasyon için gerekli morfoloji ve moleküler alt yapıya sahip olduğunu düşündürmektedir. TİB grubunda ise gland epitel hücreleri ve stromal hücrelerin gelişim ve sayısal olarak farklılık gösterdikleri ortaya çıkmıştır (Şekil 2a, 2b). Ancak endometrial ko-kültür uygulamalarının bu grup için nde oldukça faydalı sonuçlar doğurduğu bilinmektedir. Rubio ve arkadaşları¹⁹ implantasyon başarısızlığı olan kadınlarda endometrial ko-kültür uygulamaları ile daha yüksek implantasyon ve gebelik oranları elde ettiklerini belirtmişlerdir. Kumtepe ve ark. endometrial ko-kültür uygulandıktan sonra transfer edilen embriyoların gelişmiş iç hücre kitlesi yapısına sahip olduklarını, gebelik sonuçları ve devam eden gebelik oranlarında anlamlı bir artış gözlendiğini bildirmişlerdir²⁰. Bizim çalışmamıza alınan TİB grubu örneklerde de ko-kültür uygulamalarında başarılı sonuçlar elde edildiği sonucu doğrulanmaktadır.

Bazı araştırmacılar ko-kültür uygulamalarının başarısını ortaya koymak üzere ko-kültür hücreleri arasında ortaya çıkan etkileşimin morfolojik yansımalarını değerlendirmişlerdir^3,19,21. Endometriyumun gland epitel hücreleri ve stromal hücreleri ile salınan sitokinler yoluyla Otolog endometrial ko-kültür (AECC), embriyo kalitesini geliştirir ve implantasyonda önemli bir rol oynar^13,22. Embriyo gelişiminde rol oynayan çeşitli sitokinler ve büyüme faktörlerinin yanı sıra özellikle LIF salınımının başarılı endometrial implantasyonda anahtar rol oynadığı farelerde tesbit edilmiştir²³. Endometrial hücrelerin gelişiminde yavaşlama, embriyo gelişiminde eksiklik olarak fark edilecektir. Tekrarlayan IVF başarısızlığı olan hastalarda; endometriyumun rolünü belirlemek ve geliştirmek için ileri çalışmalar planlanmalıdır. AECC uygulamalarında, endometriyumu histolojik açıdan değerlendirmek faydalı bir bakış açısı getirebilir²⁴.

Son yıllarda bazı araştırmacılar tarafından embriyonun implantasyon başarısının artırılması için alternatif olarak yeni yöntemler denenmektedir. Desai ve arkadaşları, AECC uygulamalarının potansiyel dezavantajları olmaksızın, yeni bir non-kontakt insan endometrial ko-kültür sistemi elde ettiklerini bildirmişlerdir²⁵. Başka bir araştırmacı grubu da, embriyonun endometrial hücrelere tutunma ve invasion aşamalarını açıklayabilmek için yeni bir in vitro implantasyon modeli geliştirdiklerini belirtmişlerdir²⁶. İmplantasyon boyunca endometriyum ovaryan steroidlerin ve spesifik zamanlı çok sayıda sitokin salınımının etkisi altındadır. Endometriyum kaynaklı sinyaller, uyumlu bir şekilde blastosist gelişiminden ve embriyonik sinyallerin aktivasyonundan sorumludur²⁷. Yine son çalışmalarda endometrial ko-kültür sisteminde, IL-6 gibi endometrial epitel hücreleri tarafından salgılanan önemli faktörlerin katkısı göz önüne alınarak, blastosist gelişimi ve implantasyon oranlarında artış gösterilmiştir²⁸.

Bizim çalışmamızda, TİB grubunun endometrial ko-kültür gelişimi incelendiğinde, fertil gruba göre daha az hücre içerdiği gözlenmiş olup, istatiksel analizle de doğrulanmıştır (Tablo 1). Bu durum TİB grubu ko-kültür hücrelerinin, embriyonun gelişimini olumlu yönde etkileyen, fragmantasyonu azaltan ve implantasyonda oluşan başarısızlıkları çözen bazı faydalı yolaklar içerdiğini düşündürmektedir. Endometrial ko-kültür sistemlerinin blastosist gelişimi ve implantasyon üzerine olumlu etkisinin, endometrial epitelyal hücrelerin sekrete ettiği faktörlere bağlı olduğu belirtilmektedir. AECC, TİB grubu hastalarda faydalı sonuçlar vermektedir. Bu sistemdeki hücrelerin morfolojik ve moleküler özelliklerinin iyi bilinmesi için yapılacak yeni çalışmalarla, invivo ortamda implantasyon için endometriyumun yetersiz yapısının tamamlanmasına çözüm bulunmalıdır^18,29. Ancak implantasyon boyunca meydana gelen sinyaller ve bu sinyallerin embriyo ve endometrium arasındaki diyalogta ne şekilde etkili olduğunun yorumuna dair hala birçok bilinmeyen vardır. Sonuç olarak embriyo endometriyum arası etkileşimlerle ilgili olarak bilinmeyen yolakların ortaya konulabilmesi için morfolojik, fizyolojik, ve moleküler açıdan yeni çalışmalara ihtiyaç vardır.

1) Simón C, Mercader A, Garcia-Velasco J, et al. Coculture of human embryos with autologous human endometrial human endometrial epithelial cells in patients with implantation failure. J Clin Endocrinol Metab 1999; 84: 2638-46.

2) Urman B, Yakın K, Balaban B. Recurrent implantation failure in assisted reproduction: how to counsel and manage. A. General considerations and treatment options that may benefit the couple. RBM Online 2005; 11: 371-81.

3) Spandorfer SD, Barmat LI, Liu HC, et al. Granulocyte Macrophage- Colony Stimulating Factor production by autologous endometrial co-culture is associated with outcome for IVF patients with a history of multiple implantation failures. Am J Reprod Immunol 1998; 40: 377–81.

4) Barmat LI, Liu HC, Spandorfer SD, et al. Autologous endometrial co-culture in patients with repeated failures of implantation after in vitro fertilization-embryo transfer. J Assist Reprod Genet 1999; 16: 121-7.

5) Barnea ER, Check JH, Grudzinskas JG, Maruo T. Implantation and early pregnancy in humans. In: Liu HC (editor). Advanced Technologies improve embryo implantation after IVFET. 1st edition, London: The Parthenon Publishing Group, 1994.

6) Ju S, Rui R. Effects of Cumulus Cells on In Vitro Maturation of Oocytes and Development of Cloned Embryos in the Pig. Reprod in Domestic Animals. http//Onlinelibrary. Wiley.com/doi/ 21 Oct 2011.

7) Quinn P, Margalit R. Beneficial effects of coculture with cumulus cells on blastocyst formation in a prospective trial with super numerary human embryos. J Assist Reprod Genet 1996; 13: 9–14.

8) Tucker MJ, Morton PC, Wright G. Enhancement of outcome from intracytoplasmic sperm injection: does co-culture or assisted hatching improveimplantation rates. Hum Reprod 1996; 11: 2434 –7.

9) Hannan NJ, Pavia P, Dimitriadis E, Salamonsen LA. Models for Study of Human Embryo Implantation: Choice of Cell Lines? Biol of Reprod 2010; 82: 235-45.

10) Desai N, Goldfarb J. Cocultured human embryos may be subjected to widely different microenviroments; pattern of growth factor/cytokine release by Vero cells during the coculture interval. Hum Reprod 1998; 13: 1600-5.

11) Barmat LI, Worrilow KC, Payton BV. Growth factor expression by human oviduct and buffalo rat liver coculture cells. Fertil Steril 1997; 67: 775-9.

12) Nardo LG, Sabatini L, Rai R, Nardo F. Pinopode expression during human implantation. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 2002; 101: 104–8.

13) Spandorfer SD, Clarke R, Bovis L, et al. Interleukin-1 levels in the supernatant of conditioned media of embryos grown in autologous endometrial coculture: Correlation with embryonic development and outcome for patients with a history of multiple implantation failures after IVF. Am J Reprod Immunol 2000; 43: 6–11.

14) Joo BS, Kim MK, Jin NA, et al. The mechanism of action of coculture on embryo development in the mouse model: direct embryo-to-cell contact and the removal of deleterious components. Fertil Steril 2001;75: 193-9.

15) Fabbri R, Porcu E, Marsella T, et al. Human Embryo Development and Pregnancies in an Homologous Granulosa Cell Coculture System. J Assist Reprod Genet 2000; 17: 622-9.

16) Plachot M, Antoine JM, Alvarez S, et al. Granulosa cells improve human embryo development in vitro. Hum Reprod 1993; 8: 2133–40.

17) Kattal N, Cohen J, Barmat LI. Role of co-culture in human in vitro fertilization: a meta-analysis. Fertil Steril 2008; 90: 1069-76.

18) Zeyneloğlu H, Kahraman S, Pirkevi C. Co-culture techniques in assisted reproduction: history, advences and the future. J Reprod Stem Cell Biotechnol 2011; 2: 29-40.

19) Rubio C, Simon C, Mercader A, et al. Clinical experience employing co-culture of human embryos with autologous human endometrial epithelial cells. Hum Reprod 2000; 15 Suppl 6: 31-8.

20) Kumtepe Y, Kıran H, Tokat Z, Kendirci A, Çetin T. Yardımcı Üreme Tekniklerinde Ko-Kültür Kullanımı. Arşiv 2007; 16: 235-43.

21) Feng HL, Wen XH, Amet T, Presser SC. Fertilization and early embryology: Effect of different coculture systems in early human embryo development. Hum Reprod 1996; 1: 1525–8.

22) Dimitriadis E, White CA, Jones RL, Salamonsen LA. Cytokines, chemokines and growth factors in endometrium related to implantation. Hum Reprod Update 2005; 11: 613-30.

23) Fouladi-Nastha AA, Jones CJ, Nijjar N, Mohamet L, et al. Characterization of the uterine phenotype during the periimplantation period for LIF-null, MF1 strain mice. Dev Biol 2005; 281: 1-21.

24) Spandorfer SD, Soslow R, Clark R, et al. Histologic characteristics of the endometrium predicts success when utilizing autologous endometrial coculture in patients with IVF failure. J Assist Reprod Genet 2006; 23: 185-9.

25) Desai N, Abdelhafez F, Bedaiwy MA, Goldferb J. Live births in poor prognosis IVF patients using a novel non-contact human endometrial co-culture system. RBM Online 2008; 16: 869-74.

26) Zhang D, Lv P, Zhang R, et al. A new model for embryo implantation: coculture of blastocysts and Ishikawacells. Gynecol Endocrinol 2011 Nov.22 http://informahealthcare. com.

27) Armant DR. Blastocysts don’t go it alone. Extrinsic signals fine-tune the intrinsic-devolopmental program of trophoblastcells. Dev Biol 2005; 280: 260-80.

28) Dominquez F, Gadea B, Mercader A, Esteban FJ, Pellicer A, Simon C. Embriyologic outcome and secretome profile of implanted blastocysts obtained after coculture in human endometrial epithelial cells versus the sequential system. Fertil Steril 2010; 93: 774-82.

29) Bahar L. Tekrarlayan implantasyon başarısızlığı olan kadınlar ve fertil kadınların otolog endometrial doku ko-kültürlerinin ince yapı düzeyinde karşılaştırılması. Doktora Tezi. Mersin 2008.