Gereç ve Yöntem: Çalışmada, 24 adet 8 haftalık Wistar albino cinsi erkek sıçanlar kullanıldı. Deney hayvanları her grupta 6 hayvan olacak şekilde 4 gruba ayrıldı. Kontrol grubuna deney süresi olan 6 hafta boyunca hiçbir uygulama yapılmadı. Tampon grubuna sadece 0,1 M fosfat-sitrat tamponu intraperitoneal (i.p) olarak enjekte edildi. Diyabet grubuna 50 mg/kg tek doz STZ 0,1 M fosfat-sitrat tamponunda çözdürülerek i.p olarak uygulandı. Diyabet+enalapril grubuna ise 50 mg/kg tek doz STZ 0,1 M fosfat-sitrat tamponunda çözdürülerek i.p olarak uygulanmasından sonra diyabetin oluşumunu takiben enalapril 5 mg/kg/gün oral olarak verildi. Deney sonunda sıçanlar anestezi altında dekapite edildi ve mide dokuları çıkartıldı. Rutin takipler yapılarak dokular parafin bloklara gömüldü. Bloklardan alınan kesitlere ghrelin ekspresyonu için avidin-biotin-peroksidaz yöntemi uygulandı. Ghrelin ile pozitif boyanmış hücreler, eyepiece gratikül ile sayılarak istatistiksel analizleri yapıldı.

Bulgular: Ghrelin pozitif hücrelerin sayısı, kontrol ve tampon grupları arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılık göstermedi. Diyabet grubunda, kontrol ve tampon gruplarına göre belirgin azalma görüldü. Diyabet+enalapril grubundaki ghrelin pozitif hücrelerde, diyabet grubuna göre anlamlı bir artış vardı.

Sonuç: Deneysel diyabetin sıçan mide dokusunda ghrelin pozitif hücre sayısını azalttığı, tedavi olarak verilen enalaprilin bu hücrelerin sayısını arttırdığı, ileride yapılacak daha kapsamlı çalışmalarla diyabetik gastroparezis patofizyolojisinin aydınlatılmasında ghrelinin de görev alabileceği kanaatine varıldı.

DM, metabolik anormalliklerin görüldüğü morbidite ve mortaliteye neden olan bir hastalık olup akut ve kronik komplikasyonlarla seyreder². Uzun süreli hastalık, damarların yapısını bozar³. Bununla birlikte diyabetin yaygın görülen bir komplikasyonu olan fizyolojik obstruksiyon yokluğunda semptom oluşturan, gecikmiş mide boşalması olarak da tarif edilen gastroparezi tip 1 diyabetik hastalarda %27-65, tip 2 diyabetli hastalarda ise yaklaşık % 30 oranında görülmektedir⁴.

Oksidatif stres; vücuttaki oksidanlar ile antioksidanlar arasındaki dengenin oksidanlar lehine değişmesiyle meydana gelen çeşitli moleküler değişiklikleri ifade eder^5,6. Oksidatif stresin özellikle yaşlanma, diyabet, üremi, kardiyovasküler hastalıklar, malnütrisyon ve kanser gibi durumlarda önemi gösterilmiştir⁷.

Ghrelin, peptid yapıda bir hormon olup, 1999 yılında keşfedilmiştir⁸. 28 aminoasit içeren ghrelinin, iştahın ve vücut ağırlığının fizyolojik olarak düzenlenmesinin yanı sıra, insülin ve glukoz metabolizmasında da önemli rol oynadığı ileri sürülmüştür^9-11. Ghrelin dolaşımdaki glukoz seviyelerini büyüme hormonu (BH) salınımıyla, insülin direncini arttırarak ve glukoneogenezisi stimüle ederek ayarlar¹². Bazı çalışmalarda ghrelinin normal ve diyabetik sıçanların pankreasından insülin sekresyonunu uyardığı tespit edilmiş olup DM’li sıçanların langerhans adacıklarındaki ghrelin immünreaktif hücre sayısının da arttığı bildirilmiştir¹³.

Glukozun intravenöz uygulanması, insan ve kemiricilerde ghrelin seviyelerini baskılarken, insanlarda oral olarak verilen glukozun, insülinden bağımsız olarak ghrelin seviyelerini düşürdüğü gösterilmiştir^14,15.

Enalapril anjiyotensin-I’i anjiyotensin-II’ye hidrolize eden anjiotensin dönüştürücü enzim (ACE) inhibitörü olup insülin direncini düşürmesi ve antidiyabetik etkilerinden dolayı tedavide sık olarak kullanılmaktadır^16,17.

Bu çalışmada deneysel diyabetik sıçan mide dokusunda ghrelin ekspresyonu üzerine enalaprilin etkilerinin incelenmesi amaçlanmıştır.

Kontrol grubu: Bu gruba deney süresi olan 6 hafta boyunca hiçbir uygulama yapılmadı.

Tampon grubu: Bu gruba sadece 0,1 M fosfat-sitrat tamponu intraperitoneal (i.p) olarak enjekte edildi.

Diyabet grubu: Bu gruba 50 mg/kg olacak şekilde tek doz STZ 0,1 M fosfat-sitrat tamponunda (pH: 4,5) çözdürülerek i.p olarak uygulandı. Açlık kan glukoz düzeyi 250 mg/dl’yi geçen sıçanlar diyabetik olarak kabul edildi.

Diyabet + enalapril grubu: Bu gruba 50 mg/kg olacak şekilde tek doz STZ 0,1 M fosfat-sitrat tamponunda (pH: 4,5) çözdürülerek i.p olarak uygulanmasından sonra diyabetin oluşumunu takiben enalapril 5 mg/kg/gün oral olarak uygulandı. Kan glukoz düzeyleri çalışma süresince glukometre ile ölçüldü.

Tüm gruplardaki sıçanlar 6 haftalık deney sonunda ketamin (75mg/kg)+xylazine (10mg/kg) anestezisi altında dekapite edildiler. Hayvanların mide dokuları % 10’luk formaldehitte tespit edilerek rutin doku takibi sonrasında parafine gömüldü. 5mm kalınlığındaki kesitler, hematoksilen-eozin ve 4 mm kalınlığındaki kesitler de avidin-biotin-peroksidaz yöntemi uygulanarak ghrelin (Ghrelin goat poliklonal IgG, Sc-10368, Santa Cruz Biotechnology, California, USA) ekspresyonu için immünohistokimyasal olarak boyanıp ışık mikroskopunda değerlendirildi. Ghrelin ile pozitif boyanmış hücreler, her bir spesmenden rastgele seçilen 5 alanda eyepiece gratikül (1X1 mm) kullanılarak sayıldı.

Elde edilen veriler ortalamastandart sapma olarak belirlendi. Tüm istatistiksel analizler SPSS version 21 programı kullanılarak yapıldı. Gruplar arası değerlendirme One-way ANOVA, grup içi değerlendirmede ise paired t testi kullanıldı.

Büyütmek İçin Tıklayın

Tablo 1: Deney hayvanlarının başlangıç ve final kan glukoz değerleri.

Ghrelin pozitif hücreler için yapılan istatistiksel analizde kontrol ve tampon grupları arasında (Resim 1, 2) farklılık izlenmedi (p>0.05). Kontrol ve tampon grupları ile karşılaştırıldığında diyabet grubunda belirgin azalma görüldü (Resim 3) (p<0.001). Diyabet grubu ile karşılaştırıldığında diyabet+enalapril grubunda anlamlı bir artış vardı ve kontrole yakındı (Resim 4) (p<0.001) (Tablo 2).

Büyütmek İçin Tıklayın

Resim 1: Kontrol grubu mide dokusunda ghrelin pozitif hücreler (→).

Büyütmek İçin Tıklayın

Resim 2: Tampon grubu mide dokusunda ghrelin pozitif hücreler (→).

Büyütmek İçin Tıklayın

Resim 3: Diyabet grubu mide dokusunda azalmış ghrelin pozitif hücreler (→).

Büyütmek İçin Tıklayın

Resim 4: Diyabet + enalapril grubu mide dokusunda ghrelin pozitif hücreler (→).

Büyütmek İçin Tıklayın

Tablo 2: Ghrelin pozitif hücre sayıları.

DM, artmış ROS üretimi, antioksidan savunma mekanizmalarının yetersizliği ve sonuç olarak artmış oksidatif stresle bağlantılıdır^19,20. Artmış ROS üretiminin hiperglisemi haricindeki nedenleri iskemi, artmış mitokondrial kaçak, katekolamin oksidasyonu ve lökositlerdir¹⁹.

Kardiyovasküler, serebrovasküler ve nefrotik komplikasyonlar DM’nin en önemli mortalite ve morbidite nedenleri arasındadır²¹. Son zamanlarda yapılan çalışmalarda yağ dokusundan kaynaklanan adipokinlerin obezitenin komplikasyonları olan hiperlipidemi, DM, hipertansiyon, ateroskleroz ve kalp yetmezliği gibi hastalıkların patogenezinde rol oynadıkları gösterilmiştir¹.

Ghrelin oksintik bezlerden salgılanmakta olup bu bezler mide korpus ve fundusunun iç yüzeyinde bulunurlar ve mide proksimalinin % 80’ini oluşturur^22,23. Ghrelin sekresyonunun düzenlenmesindeki en önemli faktör beslenmedir. Plazma seviyeleri açlıkta artar ve gıda alımından sonra düşer^24,25. Ghrelinin besinlerin kullanımı ve metabolizmaya ait hormon salgılanmasında da etkili olduğu bilinmektedir²⁶.

Tip II DM’de ve insülin direncine sahip DM’li hastalarda ghrelin seviyeleri düşük bulunmuştur^27,28. Masaoka ve ark.²⁹ yaptıkları çalışmalarında STZ ile diyabet oluşturulmuş sıçanlarda dolaşımdaki ghrelin düzeylerini yüksek bulmakla beraber mide ghrelin seviyelerini ise düşük bulmuşlardır. Bu durumun mideden dolaşıma salınan ghrelin düzeyindeki artışa bağlı olabileceği ve muhtemel negatif enerji dengesine ile ilişkili olabileceği belirtilmiştir.

ACE inhibitörleri ve anjiotensin reseptör blokörleri gibi renin anjiyotensin sistem inhibisyonu yapan ilaçlar, insülin direncini belirgin düşürmeleri ve antidiyabetik etkilerinden dolayı, günümüzde DM gelişimi açısından metabolik pozitif etkileri olan popüler ajanlar olmuşlardır¹⁶.

Enalapril ve bu gruptaki diğer antihipertansif ilaçlar, anjiyotensin-I’i anjiyotensin-II’ye hidrolize eden ACE’yi inhibe ederler. ACE inhibitörleri, aynı zamanda güçlü bir vazodilatatör olan bradikinini aktive ettiği için vazodilatasyona sebep olurlar. Hem güçlü bir vazokonstriktör olan anjiyotensin-II’nin azalması, hem de bradikinin artması yoluyla böbrek ve kalp üzerindeki yükü azaltarak olumlu yönde etki ederler¹⁷. ACE inhibitörleri antioksidan etkilidirler ve nikotinamid adenin dinükleotidfosfat (NADPH) oksidaz enzimini inhibe ederek okside düşük yoğunluklu lipoprotein düzeyini düşürürler^30-32. Kheradmand ve ark.³³ yaptıkları çalışmalarında ghrelinin antioksidan özelliğe sahip olduğunu bildirmişlerdir.

Çalışmamızda kontrol grubu ile karşılaştırıldığında deneysel diyabet oluşturulan sıçan mide dokusunda ghrelin pozitif hücrelerde belirgin azalma izlendi. Enalapril verilen grupta ise belirgin olarak artış bulundu. Bu gruptaki artmış ghrelin hücre sayısı enalaprilin antioksidan etkisi aracılığıyla gerçekleşmiş olabilir.

Gastroparezi olarak adlandırılan gecikmiş mide boşalması DM hastalarında sık görülmekte olup retinopati, nöropati ve nefropati gibi komplikasyonlarla birliktelik göstermektedir³⁴. Çalışmamızda, diyabetik sıçan mide dokusundaki azalmış ghrelin seviyeleri gastropareziyi başlatan bir neden olarak değerlendirilmiştir. Ghrelinin intravenöz uygulanmasının sıçanlarda bazal gastrik asit sekresyonunu ve gastrik motiliteyi doza bağlı olarak arttırdığı, subkutan uygulanmasının bazal gastrik asit sekresyonuna etki göstermediği bildirilmiştir^35-38.

Sonuç olarak; deneysel diyabetin sıçan mide dokusunda ghrelin pozitif hücre sayısını azalttığı, bunun da muhtemelen negatif enerji dengesi ve oksitatif strese bağlı olabileceği ayrıca tedavi olarak verilen enalaprilin ghrelin pozitif hücre sayısını arttırdığı, bunu da enalaprilin antioksidan etkisi aracılığıyla gerçekleştirebileceği düşünülmüştür. DM’nin önemli bir komplikasyonu olan diyabetik gastroparezi patofizyolojisinin aydınlatılmasında ghrelinin de rol alabileceği kanaatine varılmış olup ileride yapılacak daha kapsamlı çalışmalara ihtiyaç vardır.

1) Yenigün M. Her Yönüyle Diabetes Mellitus. 2. Baskı. İstanbul: Nobel Tıp Kitabevi, 2001; 237-43.

2) Hawa MI, Picardi A, Costanza F, et al. Frequency of diabetes and thyroid autoantibodies in patients with autoimmune endocrine disease from Cameroon. Clin Immunol 2006; 118: 229–32.

3) Altuntaş Y. Diabetes mellitus’un tanımı, tanısı ve sınıflaması. Yenigün M (editör). Her yönüyle diabetes mellitus. 2. Baskı, İstanbul: Nobel Tıp Kitabevleri, 2001; 51-62.

4) Parkman HP, Yates K, Hasler WL, et al. Similarities and differences between diabetic and idiopathic gastroparesis. Clin Gastroenterol Hepatol 2011; 9: 1056-64.

5) Ronco C, La Greca G. Vitamin E bonded membrane, a further step in dialysis optizimation. Contrib Nephrol 1999; 127: 1-31.

6) Sies H. Oxidants and antioxidants. Exp Physiol 1997; 82: 291-5.

7) Altan N, Dinçel AS, Koca C. Diabetes Mellitus ve Oksidatif Stres. Türk Biyokimya Dergisi 2006; 31: 51-6.

8) Kojima M, Hosoda H, Date Y, Nakazato M, Matsuo H, Kangawa K. Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated peptide from stomach. Nature 1999; 402: 656–60.

9) Muccioli G, Tschöp M, Papotti M, Deghenghi R, Heiman M, Ghigo E. Neuroendocrine and peripheral activities of ghrelin: implications in metabolism and obesity. Eur J Pharmacol 2002; 440: 235-54.

10) Jarkovska Z, Hodkova M, Sazamova M, et al. Plasma levels of active and total ghrelin in renal failure: a relationship with GH/IGF-I axis. Growth Horm IGF Res 2005; 15: 369-76.

11) Wren AM, Seal LJ, Cohen MA, et al. Ghrelin enhances appetite and increases food intake in humans. J Clin Endocrinol Metab 2001; 86: 5992.

12) Muller AF, Janssen JA, Hofland LJ, et al. Blockade of the growth hormone (GH) receptor unmasks rapid GH-releasing peptide–6-mediated tissue-specific insulin resistance. J Clin Endocrinol Metab 2001; 86: 590–3.

13) Adeghate E, Ponery AS. Ghrelin stimulates insulin secretion from the pancreas of normal and diabetic rats. J Neuroendocrinol 2002; 14: 555–60.

14) McCowen KC, Maykel JA, Bistrian BR, Ling PR. Circulating ghrelin concentrations are lowered by intravenous glucose or hyperinsulinemic euglycemic conditions in rodents. J Endocrinol 2002; 175: 7–11.

15) Briatore L, Andraghetti G, Cordera R. Acute plasma glucose increase, but not early insulin response, regulates plasma ghrelin. Eur J Endocrinol 2003; 149: 403–6.

16) Gress TW, Nieto FJ, Shahar E, Wofford MR, Brancati FL. Hypertension and antihypertensive therapy as risk factors for type 2 diabetes mellitus. Atherosclerosis Risk in Communities Study. N Engl J Med 2000; 342: 905-12.

17) Atlas SA. The renin-angiotensin aldosterone system: pathophysiological role and pharmacologic inhibition. J Manag Care Pharm 2007; 13: 9-20.

18) Pitkanen OM, Martin JM, Hallman M, Akerblom HK, Sariola H, Andersson SM. Free radical activity during development of insulin dependent diabetes mellitus in the rat. Life Science 1992; 50: 335-9.

19) Pfaffly JR. Diabetic complications, hyperglicemi and free radicals. Diabetic complications 2001; 77: 1-18.

20) Van Dam PS, Bravenboer B. Oxidative stres and antioxidant treatment in diabetic neuropathy. Neuroscience Research Communications 1997; 21: 41-8.

21) Tuzun M. Endokrinoloji El Kitabı. İzmir: Ege Universitesi, 2004.

22) Guyton AC, Hall JE. Tıbbi Fizyoloji. Çavuşoğlu H, Yeğen BÇ (Çeviri Editörleri). 11. Baskı, İstanbul: Nobel Tıp Kitapevleri, 2006: 795-6.

23) Sachs G, Zeng N, Prinz C. Physiology of isolated gastric endocrine cells. Annu Rev Physiol 1997; 59: 234–56.

24) Cummings DE, Purnell JQ, Frayo RS, Schmidova K, Wisse BE, Weigle DS. A preprandial rise in plasma ghrelin levels suggests a role in meal initiation in humans. Diabetes 2001; 50: 1714–9.

25) Tschöp M, Wawarta R, Riepl RL, et al. Postprandial decrease of circulating human ghrelin levels. J Endocrinol Invest 2001; 24: 19–21.

26) Itoh FT, Komatsu T, Kushibiki S, Hodate K. Effects of ghrelin injection on plasma concentrations of glucose, pancreatic hormones and cortisol in Holstein dairy cattle. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol 2006; 143: 97–102.

27) Purnell JQ, Weigle DS, Breen P, Cummings DE. Ghrelin levels correlate with insulin levels, insulin resistance, and high-density lipoprotein cholesterol, but not with gender, menopausal status, or cortisol levels in humans. J Clin Endocrinol Metab 2003; 88: 5747–52.

28) Pöykkö SM, Kellokoski E, Hörkkö S, Kauma H, Kesäniemi YA, Ukkola O. Low plasma ghrelin is associated with insulin resistance, hypertension, and the prevalence of type 2 diabetes. Diabetes 2003; 52: 2546–53.

29) Masaoka T, Suzuki H, Hosoda H, et al. Enhanced plasma ghrelin levels in rats with streptozotocin-induced diabetes. FEBS Lett 2003; 541: 64–8.

30) Berry C, Anderson N, Kirk AJ, Dominiczak AF, McMurray JJ. Renin angiotensin system inhibition is associated with reduced free radical concentrations in arteries of patients with coronary heart disease. Heart 2001; 86: 217-20.

31) Johansen JS, Harris AK, Rychly DJ, Ergul A. Oxidative stress and the use of antioxidants in diabetes: linking basic science to clinical practice. Cardiovasc Diabetol 2005; 4: 5.

32) Onozato ML, Tojo A, Goto A, Fujita T, Wilcox CS. Oxidative stress and nitric oxide synthase in rat diabetic nephropathy: effects of ACEI and ARB. Kidney Int 2002; 61: 186-94.

33) Kheradmand A, Alirezael M, Birjandi M, 2010. Ghrelin promotes antioxidant enzyme activity and reduces lipid peroxidation in the rat ovary. Regul Pept 2010; 162: 84-9.

34) Camilleri M, Bharucha AE, Farrugia G. Epidemiology, mechanisms, and management of diabetic gastroparesis. Clin Gastroenterol Hepatol 2011; 9: 5-12.

35) Levin F, Edholm T, Ehrström M, et al. Effect of peripherally administered ghrelin on gastric emptying and acid secretion in the rat. Regul Pept 2005; 131: 59–65.

36) Edholm T, Levin F, Hellström PM, Schmidt PT. Ghrelin stimulates motility in the small intestine of rats through intrinsic cholinergic neurons. Regul Pept 2004; 121: 25–30.

37) Masuda Y, Tanaka T, Inomata N, et al. Ghrelin stimulates gastric acid secretion and motility in rats. Biochem Biophys Res Commun 2000; 276: 905–8.

38) Nakazato M, Murakami N, Date Y, et al. A role for ghrelin in the central regulation of feeding. Nature 2001; 409: 194–8.