Gereç ve Yöntem: Gaziantep Üniversitesi Tıp Fakültesi Şahinbey Araştırma ve Uygulama Hastanesi Nöroloji Polikliniği'nde takip edilen 93 Multipl skleroz hastası çalışma kapsamına alındı. Kontrol grubunu nörodejeneratif herhangi bir hastalığı bulunmayan 93 gönüllü oluşturdu. Hasta ve gönüllülerden alınan periferik kanlardan RNA izolasyonunu yapıldı. forkhead box O1 gen ifade düzeyleri RT-PCR yöntemi ile araştırıldı. Elde edilen veriler Mann-Whitney U testi yöntemi ile analiz edildi.

Bulgular: Bu çalışma sonuçlarına göre Multipl sklerozlu hastalardaki kan forkhead box O genlerinden forkhead box O1'in ifadesi sağlıklı kontrol grubuna göre farklılık göstermedi (p>0,05).

Sonuç: Bu bulgular nörodejeneratif bir hastalık olan Multipl skleroz tedavi ve tanısında daha ileri moleküler çalışmaların devamının gerekliliği ve nörodejenerasyonun baskılanmasında görevli diğer genlerin araştırılmasının önemli olacağını düşündürmektedir.

Forkhead box (FOXO) proteinleri bir transkripsiyon faktör ailesidir ve apoptosiz, hücre büyümesi, gelişimi, çoğalması ve sağ kalımında etkili olan genlerin ekspresyonunu kontrol ederler³. FOXO proteinlerinin esas belirleyici özelliği 80-100 aminoasid den oluşan “winged helix” olarak da bilinen hedef genlerin DNA‘larına bağlanabilen forkhead box bölgesidir⁴. Bu sayede hedef genleri aktive ya da inhibe ederler⁴.

Forkhead box ailesi genleri ile sinir hasarı hastalıkları arasındaki ilişkiler üzerine herhangi bir çalışmayla karşılaşılmamıştır. Bu araştırma MS ile FOXO1 geni arasındaki muhtemel ilişkiyi ortaya koymayı amaçlayan ilk çalışmadır. Bu bağlamda MS hastalığının prognozu, FOXO genlerinin yolakları ve MS hastalığında FOXO genleri işlevlerinin incelenmesi hedeflenmektedir.

Büyütmek İçin Tıklayın

Tablo 1: Hasta ve kontrol gruplarına ait yaş ortalamaları

Araştırma Yöntemleri
Gaziantep Üniversitesi Tıp Fakültesi Nöroloji kliniğinde toplanan hasta ve kontrol grubuna ait periferik kanlar uygun soğuk zincir koşullarında Fırat Üniversitesi Sağlık Bilimleri Fakültesi Moleküler Genetik Laboratuvarına getirildi. Burada kan örneklerinden RNA izolasyonu yapıldı. Daha sonra elde edilen RNA örneklerinden Ters Transkriptaz PCR yöntemi ile cDNA çevrimi gerçekleştirildi.

RNA izolasyonu High Pure RNA izolasyon kiti (RocheDiagnostics, Mannheim, Almanya) kullanılarak yapıldı. RNA örneklerden cDNA sentezi First Strand cDNA sentez (AMV) kiti (RocheDiagnostics, Mannheim, Almanya) kullanılarak yapıldı. Hedef genlerin ifade tayini için Tablo 2'de verilen primer ve problar tasarlandı.

Büyütmek İçin Tıklayın

Tablo 2: Hamarat gen (housekeeping gen) ve hedef genlerin primer dizileri ve nükleotid numaraları.

Primer ve probların tasarımı için www.roche-applied-science.com/sis/rtpcr/upl web sayfası kullanıldı. Buradan elde edilen diziler Pubmed NCBI nükleotid dizileri ile karşılaştırılarak doğrulukları tespit edildi. Primerler IDT (Integrated DNA Technologies, Belçika) firmasına sentez ettirildi. Çalışmada Universal ProbeLibrary (UPL) probları kullanıldı (RocheDiagnostics, Mannheim, Almanya). UPL probları 8-9 nükleotidlik kısa dizileri olarak, kilitli nükleotid (LockedNucleicAcid; LNA) teknolojisi kullanıldı. Real time PCR tepkimesi için 14 μl ditile su, 0,2 μl UPL probe (10 μM), 0,4 μlforward primer (10 μM), 0,4 μlreverse primer (10 μM), 4 μl Lightcyler Taqmanmaster (faststartTaq DNA polimeraz, tampon, MgCl2, dNTP karışımı), 1 μl örnek cDNA karışımı hazırlandı. Hazırlanan karışım kapiller tüplere aktarıldı. Kapiller tüpler LightCycler® 2.0real time PCR cihazına yerleştirildi. 95 °C'de 10 dakika denatürasyon yapıldı. Daha sonra 45 döngü amplifikasyon için 95 °C 10 s denatürasyon, 60 °C 30 s annealing, 72 °C 60 s extansiyon yapıldı. Son aşamada bir döngü 40 °C 30 s tutulup PCR sonlandırıldı.

İstatistiksel Analizler
İstatistiksel analizler Graphpad Instat programı kullanılarak, nonparametrik Mann-Whitney testi ile yapıldı. Örneklerin oluşturdukları pikler, Ct değerleri ve kopya sayıları ayrı ayrı analiz edilerek istatistiki hesaplamaları yapıldı. Nicel analiz sonucunda elde edilen değerler üzerinden ATCB ile normalleştirme sağlandı. Hasta/Kontrol oranları şeklinde göreceli nicel değerleri hesaplanarak Mann-Whitney U testi ile istatistiksel analizler yapıldı. Sonuçlar %95'lik güven aralığında (p<0.05) değerlendirildi.

Büyütmek İçin Tıklayın

Şekil 1: Kontrol ve hasta grubu FOXO1gen ekspresyonuRT-PCR analiz sonuçları. FOXO1 gen ifadesi hamarat gen kadar tüm hücrelerde ifade edilmektedir.

Örnekler için anlık çoğaltımın başladığı eğriler tespit edildi. Her örnek için hedef gen CT (Threshold Cycle) ve hamarat gen CT değerleri tespit edilip ΔCT oranları hesaplandı. Sonuçlar 2-ΔΔCt yöntemiyle hesaplandı.

Hastalığın oluşum seyrinde bir dizi faaliyet sonucu sitokinler, makrofajlar, mikroglial gibi diğer bağışıklık hücrelerini alana çeker ve bu hücreler TNF-α veya IFN-β gibi proinflamatuvar sitokinleri salgılayarak miyelin kılıfının doğrudan doğruya fagositik hasarını başlatırlar⁷. Hastalık, merkezi sinir sisteminde miyelin kaybından, oligodendrositlerin tam kaybına kadar değişen doku kaybına, ağır mikroglia veya astrosit çoğalmasına ve aksonal kesilerin oluşmasına neden olmaktadır⁸. Çalışmamızda özellikle bu moleküler mekanizmalardan bazılarının MS'li hastalardaki ifadelerinin etkisini araştırmayı hedefledik. Çünkü bu moleküler mekanizmaların etkisi hastalığın gidişatını önemli bir şekilde etkilemektedir.

Forkhead box ailesi genleri transkripsiyon faktörü olmalarından dolayı moleküler mekanizmalarda oldukça etkilidirler. Bu etkilerini çeşitli genlerle etkileşim halinde gerçekleştirirler. Örneğin SIRT1, dört adet bilinen FOXO proteinlerinden üçünü, yani Foxo1, Foxo3a ve Foxo4'ü deasetilize eder⁹. SIRT1 programlı hücre ölümüne neden olan stresi düşürerek ve DNA onarımının açılımını ve hücre döngüsü kontrol geçişlerini arttırarak nöronlardaki ve fibroblastlardaki Foxo3a'yı etkilemektedir⁹. Bu bağlamda özellikle nörodejenerasyonun şiddetini arttıran veya azaltan proteinlerin ifadesi hastalığın tanı ve tedavisinde önemli açılımlar sağlayabilir.

Çalışmamızda MS'li hastalarda nörodejenerasyonun şiddetini etkileyeceğini düşündüğümüz FOXO1 gen ifadesini araştırdık. Ancak hasta ve kontrol grubu arasında anlamlı bir fark tespit edemedik.

Sonuç olarak, nörodejenerasyona yol açan bağışıklık yanıtı son derece karmaşık ve birçok mekanizmanın etkisi altındadır. FOXO genlerinin MS üzerinde muhtemel etkisinin net olarak ortaya konabilmesi için tüm FOXO genlerinin ekpresyonun bu hastalık üzerinde çalışılması gerekmektedir. Bunun üzerine ilerleyen zaman diliminde FOXO ailesine ait diğer genlerinde çalışılmasına karar verilmiştir.

Multipl skleroz hastalığı gerek klinik özellikleri, gerek tedavi ve tanı yöntemleri açısından hala aydınlatılması gereken bir hastalıktır.

1) Kumar DR, Aslinia F, Yale SH, Mazza JJ. Jean-Martin Charcot: The Father of Neurology. Clin Med Res 2011; 9; 46–49.

2) Ranjan D, Bruce T. Relapsing and progressive forms of multiple sclerosis: insights from pathology. Current Opinion in Neurology 2014: 27; 271–278.

3) Kannike K, Sepp M, Zuccato C, Cattaneo E, Timmusk T. Forkhead Transcription Factor FOXO3a Levels Are Increased in Huntington Disease Because of Overactivated Positive Autofeedback Loop. The Journal of Biological Chemistry 2014: 289; 32845-32857.

4) Eckersa JC, Kalen AL, Sarsour EH et al. Forkhead Box M1 Regulates Quiescence-Associated Radioresistance of Human Head and Neck Squamous Carcinoma Cells. Radiation Research 2014: 82; 420-429.

5) de Paula A Sousa, Malmegrim KC, Panepucci RA et al. Autologous haematopoietic stem cell transplantation reduces abnormalities in the expression of immune genes in multiple sclerosis. Clinical Science 2014: 1282; 111-120.

6) Karussis D. The diagnosis of multiple sclerosis and the various related demyelinating syndromes: A critical review. Journal of Autoimmunity 2014; 48: 134-142.

7) Balasa R, Bajko Z, Maier S, Motataianu A. The dual role of transforming growth factor beta in the pathogenesis of multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. Romanian Journal of Neurology 2014; 16: 103-107.

8) Conzales GG, Avellana AV, Alli C, Baron VA. Myelination of the central nervous system, From Basic Immunology to Immun-Mediated Demyelination. Springer 1999: 101-115.

9) Kim DH, Park MH, Lee EK et al. The roles of FoxOs in modulation of aging by calorie restriction. Biogerontology 2014; 16: 1-14.